α1抗胰蛋白酶突变体ATZ过表达增强细胞自噬水平

朱 娜，冯利杰，王海萍，沈玉君，沈玉先

（安徽医科大学1.药学院、2.基础医学院、3.生物药物研究所，安徽 合肥 230032）

α1抗胰蛋白酶（α1-antitrypsin，AAT）属于丝氨酸蛋白酶超家族成员，由肝细胞合成和分泌，可以抑制包括胰蛋白酶、糜蛋白酶、凝血酶等多种蛋白酶活性，但其主要作用是通过血液循环扩散到肺部，保护肺组织弹力纤维免受中性粒细胞弹性蛋白酶的水解和破坏［1］。AAT缺乏症是一种常染色体隐性遗传病，由于编码AAT蛋白的基因突变而引起AAT分泌障碍所致，其中最常见的突变为Z型突变，该突变编码的蛋白为AAT Z突变体（α1-antitrypsin Z variant，ATZ）。AAT缺乏症最典型的临床表现为早发性肝脏疾病和肺气肿［2－3］。其中，AAT缺乏症肝脏疾病主要是由于ATZ蛋白在肝细胞内聚集造成的细胞毒性引起。我们的前期研究已发现ATZ具有细胞毒性，但其细胞毒作用的确切机制还不清楚。自噬是普遍存在于真核细胞中的一种保守的蛋白质降解途径，细胞利用溶酶体降解自身细胞器和大分子物质，实行“自我消化”，在营养缺乏、氧化应激、缺氧等条件下对细胞具有一定程度的保护作用；但是，过度激活的自噬也会引起细胞的损伤，甚至细胞死亡［4］。研究发现，引起细胞毒性的ATZ聚集体部分会被自噬体包裹并降解，而对于自噬在过表达ATZ所引起的细胞毒性过程中是否发挥着一定的作用尚不清楚［5］。本研究通过在293T细胞中过表达ATZ蛋白，检测细胞自噬相关基因和蛋白表达及自噬体的形成，观察ATZ对自噬活性和细胞形态的影响，从而为其细胞毒性作用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 试剂及抗体DMEM高糖培养基，Opti-MEM，Lipofectamine 2000购自Gibco公司，小牛血清（fatal bovine serum，FBS）购自杭州四季青公司，预染蛋白分子量Marker购自Fermentas公司，PVDF膜为GE公司产品，ECL发光试剂盒购自Pierce公司，NH4Cl购自上海生工产品，p62、LC3、α-tubulin多克隆抗体购自Sigma公司，Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG（H＋L）和 Alexa Fluor 350 donkey anti-goat IgG（H＋L）购自Invitrogen公司，DAB显色试剂盒购自中衫金桥公司，SYBR Premix EX Tag购自宝生生物工程（大连）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 质粒转染 293T细胞按5×105个细胞/孔接种于6孔板，在5%CO237℃恒温培养箱中培养，直至转染前细胞密度达到80%～90%；质粒转染采用Lipofectamine 2000，操作方法按试剂说明书进行，转染后的细胞在含5%CO237℃恒温培养箱中培养6 h后，更换培养液。

1.2.2 细胞免疫荧光染色和DAB染色 接种于24孔板的细胞去除培养液，4%多聚甲醛4℃固定10 min，PBS洗 5 min×3次，用含 1.0 g·L－1牛血清白蛋白和1.0 g·L－1皂素的PBS于4℃透膜封闭处理0.5 h，加入DAB染色的一抗，37℃孵育2 h，PBS洗5 min×3次，依次加SP试剂盒中的B，C液，DAB显色；PBS洗5 min×3次后加入适当稀释度的一抗，37℃孵育2 h，PBS洗5 min×3次，加入适当稀释度的荧光二抗37℃避光孵育1 h，DAPI（5 mg·L－1）孵育10 min衬染核，PBS洗5 min×3次，共聚焦显微镜或荧光显微镜采集图片。

1.2.3 蛋白质免疫印迹 收集6孔板中转染后的细胞，用含蛋白酶抑制剂的蛋白裂解液冰上裂解细胞30 min，100℃变性15 min。SDS-PAGE凝胶电泳后湿转至PVDF膜。用含0.5 g·L－1脱脂奶粉的PBST封闭30 min后，加入适当稀释度的一抗室温孵育2 h，PBST洗10 min×3次，加入适当稀释度的二抗室温结合1 h，PBST洗10 min×3次，ECL显影。

1.2.4 real-time PCR 反应总体积10μl，SYBR Premix Ex Taq 5μl，cDNA模板1μl，双蒸水3.2μl，引物0.8μl，反应条件为：94℃变性2 min，94℃变性10 s，57℃退火10 s，72℃延伸20 s，45个循环。Beclin1上游引物：5′-CAA GATCCTGGACCGTGTCA-3′，下游引物：3′-TGGCACTTTCTGTGGACATCA-5′；Atg5上游引物：5′-AGAATAGCCAGTACAGCA-3′，下游引物：3′-ATGAA CCGACGAATAAAC-5′；Atg12上游引 物：5′-GCGAACACGAACCATCCA-3′，下 游 引物：3′-CCACGCCTGAGACTTGCA-5′。

2 结果

2．1 ATZ表达对自噬相关蛋白LC3和p62表达的影响为了检测ATZ表达对细胞自噬的影响，我们观察了自噬相关蛋白：微管相关蛋白1轻链3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）和p62的表达。结果发现，转染表达正常AAT蛋白质粒（pcDNA3.1-zeo＋-ATM）的细胞相比，ATM（alpha1-antitrypsin M phenotype）为正常活性 AAT，转染Z型突变体质粒（pcDNA3.1zeo＋-ATZ）的细胞中LC3-Ⅱ/Ⅰ增加，提示ATZ能增加自噬体形成（Fig 1）；同时转染ATZ的细胞中p62水平明显降低，而溶酶体抑制剂氯化铵（25 mmol·L－1）作用4 h能增加p62水平（Fig 1），提示ATZ增加细胞自噬水平，增加p62降解。

2．2 ATZ表达对细胞自噬体形成的影响同上转染细胞，并用氯化铵抑制溶酶体降解功能，免疫荧光双标结果显示，ATZ表达少的细胞中LC3弥散在胞质中（Fig 2，细箭头所示）；而ATZ表达多的细胞中可以看到大量LC3的点状聚集（Fig 2，粗箭头所示），并且与ATZ共定位，提示ATZ能促进细胞内自噬体的形成。

Fig 1 ATZ overexpression increases LC3-Ⅱ/Ⅰand facilitates p62 degradation

2．3 ATZ表达对细胞自噬相关基因的影响为了进一步了解ATZ对细胞自噬水平的影响，我们观察了自噬关键基因Atg5、Atg12和Beclin1的表达。与转染空质粒的细胞相比，过表达ATZ的细胞中Atg5和Atg12的mRNA水平明显增加（Fig3 A，B），而对Beclin1水平无明显影响（Fig 3C）。

2．4 ATZ诱导的自噬水平增加对细胞形态的影响

为了观察ATZ诱导的细胞自噬水平增加对细胞形态的影响，我们同上转染细胞，用免疫细胞染色法检测表达ATZ细胞的形态和LC3水平。结果发现，在少量表达ATZ的细胞中，细胞及细胞核形态趋向正常，LC3表达增加，呈点状聚集在胞质中；ATZ表达高的细胞体积较小或偏圆，细胞核变小、致密或淡染、碎裂甚至消失，破碎；胞质中无 LC3表达（Fig 4）。

3 讨论

AAT是体内重要的蛋白酶抑制物，能抑制包括胰蛋白酶、糜蛋白酶、凝血酶、胶原酶、纤溶酶、尿激酶等多种蛋白酶，其缺乏可引起系统性脉管炎、坏死性脂膜炎、肝脏以及肺部疾病。肝脏疾病包括肝炎、肝硬化和肝癌是AAT缺乏症患者尤其是肝细胞内有AAT多聚体患者明显的临床表现［6］。自噬是一个调控细胞内容物的降解和再循环的过程，通过参与细胞器的代谢、降解以及再利用等维持正常细胞功能。其特征是首先在细胞质中形成月牙形的膜结构，包裹待降解物质后形成的泡状结构称为自噬体，随后自噬体与溶酶体发生融合，自噬所包裹着的待降解物质进入溶酶体中被降解。自噬作为一种细胞生存的机制，在很多生理过程如抵抗营养缺乏、清除损坏的细胞器、降解细胞内异常蛋白质中发挥重要作用［7］；然而过度的自噬则会形成自噬应激，损伤细胞器，如造成线粒体功能障碍等，从而产生细胞毒性。

Fig 2 ATZ co-localizeswith LC3 and increases LC3 puncta after autophagy inhibition by NH 4 Cl

Fig 3 ATZ overexpression increases themRNA levels of Atg5 and Atg12±s）

Fig 4 Effect of ATZ expression on cellmorphologies

为了探究ATZ细胞毒性是否与诱导细胞自噬有关，我们在293T细胞中过表达ATZ，观察LC3-Ⅱ/Ⅰ比值的变化以及p62水平。LC3是自噬体膜标志性蛋白，有LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ两种亚型；自噬形成时，胞浆型 LC3（即 LC3-Ⅰ）会酶解掉一小段多肽，转变为（自噬体）膜型（即 LC3-Ⅱ），因此，LC3-Ⅱ/Ⅰ比值的大小可估计自噬水平的高低。p62是一个自身可通过自噬特异性降解的多功能蛋白，p62水平降低在一定程度上反映了自噬水平的增加。我们的结果显示，过表达ATZ细胞中LC3-Ⅱ/Ⅰ比值增加，p62水平降低，而氯化铵抑制自噬后p62水平恢复，提示ATZ能增加细胞自噬。为了更直观的反映ATZ对细胞自噬体形成的影响，我们采用氯化铵抑制溶酶体活性，利用LC3在自噬形成过程中发生聚集的现象观察ATZ对自噬体数量的影响，结果发现过表达ATZ后 LC3点状聚集明显增加［8］，提示ATZ能促进细胞内自噬体形成。

通常情况下，细胞自噬的发生依赖于一系列Atg家族蛋白，其中 Beclin1是酵母 Atg6/Vps30基因在哺乳动物中的同源物，通过与ClassⅢPI3K形成复合物参与自噬体初期自噬体膜的形成［9］；另外，Atg5在细胞内形成Atg12-Atg5复合物，能促使LC3-Ⅰ到LC3-Ⅱ的转变，对自噬体膜的延伸至关重要［10］。Q-PCR结果显示，过表达 ATZ细胞内自噬相关基因Atg5和Atg12的mRNA水平明显升高，而对Beclin1的mRNA水平无明显影响。因此我们猜测，过表达ATZ可能通过作用Atg5-Atg12复合物参与自噬体膜延伸环节而非自噬体膜初期形成阶段。另外，我们发现表达ATZ的细胞自噬活性的增加，但ATZ过度表达的细胞形态明显异常，核分叶、固缩、碎裂或消失，这与我们前期结果一致［11］。

综上所述，细胞自噬在过表达ATZ的细胞模型中可能发挥着双重作用；一方面，在早期阶段自噬的诱导加速了蛋白聚集体的清除，对细胞起保护作用；另一方面，蛋白聚集体因细胞自噬活性改变而不能有效降解，最终会导致细胞毒性。过表达ATZ可能通过影响Atg5-Atg12复合物影响自噬，至于确切的作用机制还需进一步的实验证实。

参考文献：

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