表没食子儿茶素没食子酸酯对柔红霉素致小鼠心脏毒性的预防作用*

李丽,唐燕霞,黄志明,陈润丽,周焕第,刘布鸣,梁钢

(1.广西医科大学药学院,南宁 530021;2.广西中医药大学药学院,南宁 530001;3.广西中药质量标准研究重点实验室,南宁 530022)

·药物研究·

表没食子儿茶素没食子酸酯对柔红霉素致小鼠心脏毒性的预防作用*

李丽1,2,唐燕霞1,黄志明1,陈润丽1,周焕第2,刘布鸣3,梁钢1

(1.广西医科大学药学院,南宁 530021;2.广西中医药大学药学院,南宁 530001;3.广西中药质量标准研究重点实验室,南宁 530022)

目的 观察表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对柔红霉素(DNR)所致小鼠心脏毒性的预防作用。方法将合格小鼠随机分为4组,即正常对照组、模型对照组(DNR致心脏毒性组)、EGCG高剂量组(80 mg·kg-1)、EGCG低剂量组(40 mg·kg-1)。给予EGCG 7 d后,除正常对照组外,其余各组小鼠腹腔注射DNR(15 mg·kg-1)。48 h后检测心电图、血清心肌酶谱、高敏肌钙蛋白T(TNT-Hs)、心肌超微结构。结果模型对照组小鼠心律失常发生率64.7%,丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶MB同工酶(CK-MB)、乳酸脱氢酶(LDH)、α-羟基丁酸脱氢酶(α-HBDH)和TNT-Hs显著高于正常对照组(P＜0.01),心肌超微结构明显损伤;EGCG高剂量组小鼠心律失常发生率44.4%,EGCG低剂量组小鼠心律失常发生率31.6%;EGCG各剂量组小鼠血淸心肌酶及TNTHs较模型对照组显著降低(P＜0.05或P＜0.01);EGCG低剂量组小鼠心肌超微结构损伤较模型对照组明显减轻。结论EGCG对DNR所致小鼠心脏毒性有一定的预防作用。

表没食子儿茶素没食子酸酯;柔红霉素;心脏毒性;心肌酶

柔红霉素(daunorubicin,DNR)属于蒽环类药物。蒽环类药物是一类非常有效且常用的抗肿瘤药物,抗肿瘤谱较广。在临床化疗方案中,蒽环类药物的作用呈现出明显的剂量-效应关系,但随着剂量的增加,其不良反应也愈加突出,尤其是心脏毒性,使其应用受到了限制,目前尚无较理想的药物能够预防和治疗[1]。表没食子儿茶素没食子酸酯[(-)-epigallocatechin gallate,EGCG]有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗动脉硬化、抗炎、抗肿瘤及防治糖尿病肾病的作用[2-3]。研究发现,EGCG可以缓解DNR引起的裸鼠体质量减轻,对DNR引起的裸鼠血液中心肌肌钙蛋白T(troponin T, cTnT)和膜脂质过氧化产物丙二醛(malondialdehyde, MDA)升高有抑制作用[4]。但EGCG对DNR所致小鼠心脏毒性有无保护作用,笔者未见报道。笔者在本研究中建立DNR致小鼠急性心脏毒性模型,观察EGCG对心电图、心肌酶谱、高敏肌钙蛋白T(highsensitivity troponin T,TNT-Hs)、心肌超微结构等的影响,探讨EGCG对DNR致心脏毒性的保护作用。

1 材料与方法

1.1 动物 昆明种小鼠,清洁级,80只,雌雄各半,体质量(20±2)g,购自广西医科大学实验动物中心。实验动物使用许可证号:SYXK(桂)2009-0004,实验动物生产质量合格证号:SCXK桂2009-0002。

1.2 药物与试剂 DNR(Actavis Italy S.p.A.,批号: 1F10111)。EGCG(含量:97%,HPLC法,杭州禾田生物技术有限公司,批号:20100125,临用前用0.5%羧甲基纤维素钠溶液制成混悬液)。丙氨酸氨基转移酶(alanine transaminase,ALT,批号:20130403)、天冬氨酸氨基转移酶(aspartate transaminase,AST,批号: 20130401)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH,批号:20130405)试剂盒为上海执诚生物科技股份有限公司产品;肌酸激酶(creatine kinase,CK,批号: 20130205)、肌酸激酶MB同工酶(creatine kinase MB isoenzyme,CK-MB,批号:20130210)、α-羟基丁酸脱氢酶(alpha hydroxybutyrate dehydrogenase,α-HBDH,批号:20130201)试剂盒为德赛诊断系统(上海)有限公司产品。TNT-Hs检测试剂盒(批号:20130418)为罗氏公司产品。

1.3 仪器 BL-420E生物机能实验系统(成都泰盟科技有限公司);7600-020AutomaticAnalyzer (HITACHI);罗氏Cobas 6000;H-7650型透射电镜(日本日立)。

1.4 模型的制备及给药 健康小鼠适应性喂养1周后,检测心电图,取正常者采用随机数字表进行完全随机化分组,共分为4组,即正常对照组、模型对照组、EGCG高剂量组(80 mg·kg-1)、EGCG低剂量组(40 mg·kg-1)。每组20只,雌雄各半。EGCG各剂量组分别灌胃给药(20 mL·kg-1),正常对照组和模型对照组灌胃给予等体积溶剂,即0.5%羧甲基纤维素钠溶液。每天1次,共7 d。在末次灌胃给药1 h后,除正常对照组腹腔注射等体积0.9%氯化钠溶液外,其余各组小鼠腹腔注射DNR(15 mg·kg-1),复制DNR急性心脏毒性模型[5]。

1.5 观察指标

1.5.1 症状和体征 观察小鼠一般生长状况、外观、饮食等。

1.5.2 心电图 注射DNR 48 h后,小鼠用3%水合氯醛腹腔注射麻醉,仰卧固定,采用标准肢体II导联描记心电图,观察心律失常的发生率。本实验中,出现各种类型的期前收缩、房室传导阻滞、窦性心动过速、窦性心动过缓等之一者为心律失常阳性[6]。

1.5.3 TNT-Hs测定 采用化学发光法检测血清TNT-Hs含量。

1.5.4 血清ALT、AST和心肌酶谱 记录心电图后,小鼠摘眼球取血,分离血清,在全自动生化分析仪上测定ALT、AST和心肌酶谱(CK、CK-MB、LDH、α-HBDH)活性。

1.5.5 电镜观察 小鼠采血后,迅速开胸取心脏,用预冷0.9%氯化钠溶液冲洗,滤纸吸干后称质量。取心尖部米粒大小心肌,2.5%戊二醛和1%锇酸双重固定,丙酮脱水,树脂包埋,超薄切片,1%醋酸双氧铀及枸橼酸铅双重染色,透射电镜观察。

1.6 统计学方法 采用SPSS13.0版统计软件,实验数据计量资料以均数±标准差(±s)表示,组间比较采用单因素方差分析,两组样本率比较采用Fisher's确切概率法,P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 EGCG对DNR致心脏毒性小鼠一般状况的影响 正常对照组小鼠活动、摄食、粪便、皮毛等生长状况良好;腹腔注射DNR后1 d,模型对照组小鼠出现活动迟缓、摄食减少、竖毛等;除正常对照组外,其余各组小鼠陆续出现死亡,最后剩余小鼠数为:模型对照组17只,EGCG高剂量组18只,EGCG低剂量组19只。但EGCG给药组小鼠一般状况好于模型对照组。

2.2 EGCG对DNR致心脏毒性小鼠心电图的影响 注射DNR 48 h后,模型对照组小鼠心律失常发生率显著高于正常对照组(P＜0.01);EGCG低剂量组与模型对照组比较,心律失常发生率有所降低(P＜0.05)。结果见表1。

2.3 EGCG对DNR致心脏毒性小鼠血清TNT-Hs的影响 模型对照组血清TNT-Hs显著高于正常对照组(P＜0.01)。与模型对照组比较,EGCG高、低剂量组血清TNT-Hs显著降低(P＜0.01),见表2。

表1 4组小鼠心电图测定结果Tab.1 Determination results of electrocardiogramin four groups of mice

表2 4组小鼠TNT-Hs测定结果Tab.2 Determination results of TNT-Hs in four groups of mice ±s

表2 4组小鼠TNT-Hs测定结果Tab.2 Determination results of TNT-Hs in four groups of mice ±s

与正常对照组比较,*1P＜0.01;与模型对照组比较,*2P＜0.01Compared with normal control group,*1P＜0.01;Compared with model control group,*2P＜0.01

组别小鼠/只剂量/ (mg·kg-1) TNT-Hs/ (ng·mL-1)正常对照组20…0.04±0.01模型对照组17…0.23±0.06*1EGCG高剂量组18800.06±0.01*2低剂量组19400.06±0.02*2

2.4 EGCG对DNR致心脏毒性小鼠血清ALT、AST和心肌酶谱的影响 模型对照组血清ALT、AST和心肌酶谱(CK、CK-MB、LDH、α-HBDH)活性均显著高于正常对照组(P＜0.01)。EGCG高、低剂量组血清ALT、AST和心肌酶活性较模型对照组明显降低(P＜0.05或P＜0.01),见表3。

表3 4组小鼠血清ALT、AST和心肌酶谱测定结果Tab.3 Determination results of ALT,AST and myocardial enzymes in four groups of mice U·L-1,±s

表3 4组小鼠血清ALT、AST和心肌酶谱测定结果Tab.3 Determination results of ALT,AST and myocardial enzymes in four groups of mice U·L-1,±s

与正常对照组比较,*1P＜0.01;与模型对照组比较,*2P＜0.01,*3P＜0.05Compared with normal control group,*1P＜0.01;Compared with model control group,*2P＜0.01,*3P＜0.05

组别小鼠/只剂量/ (mg·kg-1)ALTASTCKLDHCK-MBα-HBDH正常对照组20…57.6±15.4135.7±30.6597.9±357.4712.7±246.5401.2±97.9256.1±102.3模型对照组17…105.9±49.8*1349.3±115.3*12 272.4±606.5*11 349.2±301.0*11 039.79±249.4*1551.8±179.3*1EGCG高剂量组188060.8±14.1*2232.6±33.3*21 711.3±657.3*3955.4±276.6*2889.7±145.7*3370.1±118.1*2低剂量组194062.6±40.1*2254.2±58.0*21 422.2±504.8*2747.0±119.9*2807.9±136.2*2282.2±55.6*2

2.5 EGCG对DNR致心脏毒性小鼠心肌超微结构的影响 正常对照组心肌细胞排列有序,肌纤维肌小节结构清晰,线粒体含量丰富,包膜完整,线粒体嵴密度适中(图1A)。与正常对照组相比,模型对照组心肌细胞肿胀,部分肌丝断裂,排列紊乱,线粒体肿胀,线粒体嵴出现断裂(图1B)。EGCG低剂量组心肌细胞心肌纤维结构基本正常,少数线粒体嵴断裂,个别肌丝溶解,线粒体肿胀较轻,心肌损伤明显轻于模型对照组(图1C)。

3 讨论

人应用DNR治疗时,当DNR的累积剂量超过300 mg·(m2)-1,易出现严重的心脏毒性,其早期急性心脏毒性的特征性之一表现为心律失常[7-8],因此心电图是监测DNR心脏毒性的重要指标之一。研究表明,在人类肝脏中广泛存在的羰基还原酶1能将DNR转化成一种新的醇代谢物柔红霉素醇。这种新生成的醇代谢物不仅抗肿瘤活性比DNR低,还会对心脏产生毒性,造成心肌细胞损伤[9]。心肌细胞膜受损,细胞内的多种酶外漏,如LDH、CK等,严重影响细胞功能[10]。因此,血清ALT、AST和心肌酶谱(CK、CK-MB、LDH、α-HBDH)是临床反映心肌损害的主要生化指标,其可信度高,重复性好。TNT-Hs为心肌结构蛋白,在心肌细胞膜完整时,不能透过细胞膜进入血循环,因此正常人血清中含量极微。而当心肌细胞因缺血缺氧受到损伤时,由于细胞膜的通透性增高,TNT-Hs通过细胞膜进入外周血。TNT-Hs是心肌细胞损伤的高敏感性标志物,可检出某些心肌酶谱不能检出的微小心肌损伤,逐渐成为诊断心肌损伤首选的血清标志物[11]。本实验表明,单次腹腔注射DNR 15 mg·kg-1可诱发小鼠心律失常,ALT、AST、CK、CK-MB、LDH、α-HBDH水平升高,TNT-Hs释放增多,心肌超微结构明显损伤,DNR致小鼠心脏毒性模型复制成功。

A.正常对照组(×15 000);B.模型对照组(×15 000);C.EGCG低剂量组(×20 000)图1 EGCG对DNR致心毒性小鼠心肌超微结构的影响A.Normal control group(×15 000);B.model control group(×15 000);C.EGCG 40 mg·kg-1group(×20 000)Fig.1 Effect of EGCG on myocardial ultrastructure of mice with DNR-induced cardiotoxicity

EGCG药理作用广泛,不仅具有抗氧化、抗紫外线辐射、抗菌等作用,还具有抗癌、抗突变、预防和治疗心脑血管系统疾病以及调理内分泌、免疫系统等生物活性[12]。EGCG能增强阿糖胞苷对人白血病HL-60细胞的抗肿瘤活性[13]。在裸鼠肝癌移植瘤实验中,EGCG可有效抑制羰基还原酶的代谢活性,增强DNR抗肿瘤作用并降低其心脏毒性[4]。本研究结果显示,预先给予EGCG,可以改善DNR所致心脏毒性小鼠的一般生长状况,降低心律失常发生率,抑制血清心肌酶增高,降低血清TNT-Hs含量,减轻心肌超微结构损伤,从而预防DNR的心脏毒性,其可能机制是通过抑制羰基还原酶,减少DNR代谢为柔红霉素醇。由此笔者设想EGCG与DNR联用,可能既预防或减轻DNR对心肌的损伤,又协同或增强DNR的抗肿瘤作用。这一研究结果或可为肿瘤的药物防治提供新的思路,也将为EGCG的进一步研发提供实验依据。

[1] 吕俊,丁念,朱家蔷,等.蒽环类药物心脏毒性及其预防的研究进展[J].中国医院药学杂志,2008,28(15): 1302-1303.

[2] 刘礼,谢纪文,王熙.表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)的抗肿瘤机制及放射增敏作用的研究进展[J].中西医结合研究,2009,1(4):222-224.

[3] 李彩蓉,杨晓,朱忠华,等.表没食子儿茶素没食子酸酯治疗大鼠糖尿病肾病[J].医药导报,2005,24(10):877-879.

[4] HUANG WX,DING L Y,HUANG Q,et al.Carbonyl reductase 1 as a novel target of(-)-Epigallocatechin Gallate against hepatocellular carcinoma[J].Hepatology,2010,52 (2):703-714.

[5] 赖永洪,翟莺莺,叶铁真.槲皮素对柔红霉素所致心肌损伤的保护作用[J].现代临床医学生物工程学杂志, 2005,11(1):15-18.

[6] 裴天仙,徐长庆,李滨,等.槲皮素对多柔比星致小鼠心肌损伤的保护作用及其机制[J].药学学报,2007,42 (10):1029-1033.

[7] DAVIES K J,DOROSHOWJ H.Redox cycling of anthracyclines by cardiac mitochondria.I.Anthracycline radical formation by NADH dehydrogenase[J].J Biol Chem,1986, 261(7):3060-3067.

[8] 庄艳,刘先领.蒽环类药物心脏毒性及其预防措施[J].肿瘤药学,2011,1(4):322-326.

[9] FORREST G L,GONZALEZ B,TSENG W,et al.Human carbonyl reductase overexpression in the heart advances the developmentofdoxorubicin-inducedcardiotoxicityin transgenic mice[J].Cancer Res,2000,60(18):5158-5164.

[10] 周致,陈瑗.自由基医学基础与病理生理[M].北京:人民卫生出版社,2002:369.

[11] 刘祥红,胡红霞.三项心肌标志物定量检测对急性心肌梗死诊断的临床意义[J].宁夏医学杂志,2012,34(8): 787-788.

[12] 蒋莎莉,罗招阳.表没食子儿茶素没食子酸酯抗肿瘤作用的研究进展[J].中外医学研究,2009,7(14):64-65.

[13] 戴建子,徐峰,傅晓霞,等.表没食子儿茶素没食子酸酯增强阿糖胞苷对HL-60细胞的抗肿瘤活性[J].中国医院药学杂志,2002,22(8):458-461.

DOI 10.3870/yydb.2014.07.001

Protective Effects of(-)-Epigallocatechin Gallate on Daunorubicin-induced Cardiotoxicity in Mice

LI Li1,2,TANG Yan-xia1,HUANG Zhi-ming1,CHEN Run-li1,ZHOU Huan-di2,LIU Bu-ming3,LIANG Gang1
(1.Pharmaceutical College,Guangxi Medical University,Nanning 530021,China;2.Pharmaceutical College, Guangxi University of Chinese Medicine,Nanning 530001,China;3.Guangxi Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Quality Standards,Nanning 530022,China)

ObjectiveTo investigate the protective effects of(-)-epigallocatechin gallate(EGCG)on daunorubicin (DNR)-induced cardiotoxicity in mice.MethodsThe qualified mice were randomly divided into four groups:normal control group,myocardial injured model control group,high dose group(80 mg·kg-1)and lowdose group(40 mg·kg-1)of EGCG. EGCG was administered intragastrically once daily for 7 days,followed by a single intraperitoneal injection of DNR(15 mg·kg-1) except in the normal control group.The electrocardiogram,myocardial enzymes and TNT-Hs in serum,cardiac ultrastructure of mice were detected after 48 h.ResultsIn DNR model control group,the incidence of arrhythmia was 64.7%.The activity of serumcardic enzymes including CK,CK-MB,LDH,α-HBDH and ALT,AST,level of TNT-Hs were significantly higher than those in the normal control group(P＜0.01),and myocardial ultrastructure was injured remarkably.The incidence of arrhythmia was 44.4%in mice treated with high dose of EGCG and 31.6%in mice with lowdose of EGCG.Compared to the model control group,the activity of CK,CK-MB,LDH,α-HBDH and ALT,AST,level of TNT-Hs in serumdecreased remarkably in EGCG groups(P＜0.05 or P＜0.01).Lowcan EGCG alleviated the injury to the ultrastructure of myocardiumcompared to the model control group.ConclusionEGCG can prevent the cardiac toxicity induced by DNR in mice.

(-)-Epigallocatechin gallate;Daunorubicin;Cardiotoxicity;Myocardial enzymes

R286;R965

A

1004-0781(2014)07-0841-04

2013-08-28

2013-09-22

*国家自然科学基金资助项目(81160532);教育部博士点基金博导类课题(20134503110007);广西自然科学基金资助项目(2012GXNSFAA053147);广西中药质量标准研究重点实验室(广西壮族自治区中医药研究院)开放课题基金项目(桂中重开201105)

李丽(1973-),女,广西东兰人,副教授,硕士生导师,博士,主要从事中草药药效及抗肿瘤分子药理学研究。电话:0771-2279423,E-mail:lilygxnn@163.com。

梁钢(1957-),男,广东顺德人,教授,博士生导师,博士,主要从事抗肿瘤分子药理学及其新药的研究。电话: 0771-5302271,E-mail:lianggang22@aliyun.com。