活血消瘿片对实验性大鼠甲状腺肿的影响*

田先翔,王瑞,泮剑英,吴勇,鲁云,郑国华

(湖北中医药大学药学院,武汉 430065)

活血消瘿片对实验性大鼠甲状腺肿的影响*

田先翔,王瑞,泮剑英,吴勇,鲁云,郑国华

(湖北中医药大学药学院,武汉 430065)

目的 研究活血消瘿片对实验性大鼠甲状腺肿模型的影响及其作用机制。方法将SD大鼠随机分为6组:正常对照组,模型对照组,活血消瘿片低、中、高剂量组,左甲状腺素钠组。除正常对照组外,其余各组大鼠连续灌服丙基硫氧嘧啶(20 mg·kg-1·d-1)造模。活血消瘿片低、中、高剂量组同时灌服活血消瘿片水溶液,剂量分别为4.4, 8.8,17.6 g·kg-1·d-1;左甲状腺素钠组灌服左甲状腺素钠片,7.8 μg·kg-1·d-1。60 d后测定大鼠甲状腺、垂体的脏器指数以及血清中游离三碘甲状腺氨酸原氨酸(FT3)、游离甲状腺素(FT4)及促甲状腺素(TSH)含量,甲状腺、垂体做病理学检查,免疫荧光法观察其组织中碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、转化生长因子β(TGF-β)和B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)基因的表达。结果与模型对照组比较,活血消瘿片低、中、高剂量组甲状腺指数均明显降低(P＜0.05),垂体指数无明显改变(P＞0.05);FT3、FT4有升高趋势,TSH有降低趋势,但差异无统计学意义(P＞0.05);病理检查结果显示,与模型对照组比较,活血消瘿片各剂量组甲状腺形态结构有较大改善,腺体扩张,甲状腺滤泡恢复呈中等大小,上皮细胞呈立方或扁平状,滤泡腔内充满丰富胶质,bFGF、Bcl-2阳性表达明显降低(P＜0.01),TGF-β阳性表达明显升高(P＜0.01)。结论活血消瘿片具有较好的抗甲状腺肿大作用,其机制可能与促进甲状腺细胞凋亡、抑制甲状腺细胞增殖有关。

活血消瘿片;甲状腺肿;药效;免疫荧光

活血消瘿方是湖北中医药大学附属医院名老中医陈如泉教授治疗结节性甲状腺肿(nodular goiter,NG)的经验方,该方以桃仁与莪术为主药[1],对NG有肯定的临床疗效。临床观察表明,活血消瘿片治疗NG总有效率为87.9%[2],经活血消瘿片治疗的患者NG症状明显缓解(甲状腺肿大缩小,甚至消失),治疗效果明确[3-4]。笔者在本实验中观察活血消瘿片对实验性甲状腺肿大鼠的治疗作用并初步探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物 SD大鼠,雄性,体质量120～150 g;雌性,体质量100～120 g。SPF级,共96只,雌雄各半。由湖北省实验动物中心提供,动物合格证号:NO. 4200600507,动物生产许可证号:SCXK(鄂)2008-005,雌雄分笼饲养。

1.2 试药 丙硫氧嘧啶片(上海朝晖药业有限公司,规格:每片50 mg,批号:101201),左甲状腺素钠片(商品名:优甲乐,德国默克雪兰诺有限公司,批号: 133339,规格:每片50 μg);活血消瘿片(湖北中医药大学附属医院制剂室提供,处方由土鳖虫、蜈蚣、蜣螂虫、桃仁、莪术、王不留行、猫爪草、柴胡等八味药组成,规格:每片0.28 g,批准文号:鄂药制字Z20113144,批号:20110314);游离三碘甲状腺氨酸原氨酸(free triiodothyronine,FT3)测定试剂盒、游离甲状腺素(free thyroxin,FT4)测定试剂盒、促甲状腺素(thyroid stimulating hormone,TSH)测定试剂盒(批号分别为006194,113033,114256,siemens Healthcare Diagnostics Inc);荧光一抗碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF,GR24716-13,abcam);荧光一抗转化生长因子β(transforming growth factor-β, TGF-β,GR112432-2,abcam),荧光一抗抗B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma 2 gene,Bcl-2,GR118914-1, abcam);荧光二抗Bcl-2和bFGF为CY3标记的山羊抗兔、TGF-β为CY3标记的山羊抗小鼠(Jakson,批号: 109626,109626,110030);牛血清清蛋白(albumin frombovine serum,BSA,上海罗氏制药有限公司,批号: 121E058,);4',6-二脒基-2-苯基吲哚抗荧光淬灭封片剂(diamidino-2-phenylindole dihydrochloride,DAPI,上海碧云天生物技术有限公司,批号:0803021321, 0603141323)。

1.3 仪器 精密电子天平(FA2104N,上海菁海仪器有限公司);倒置荧光显微镜(NIKON ECLIPSE TI-SR,日本尼康)。

1.4 动物造模与给药 大鼠适应性饲养1周后,按体质量分层随机分为6组[5],即正常对照组,模型对照组,活血消瘿片低、中、高剂量组,左甲状腺素钠组。参考文献[6-7]方法,结合本实验室预实验结果对大鼠进行处理。正常对照组大鼠每天灌胃给予0.9%氯化钠溶液2 mL·kg-1,其余各组大鼠每天灌胃给予丙硫氧嘧啶20 mg·kg-1造甲状腺肿模型[将丙硫氧嘧啶用0.9%氯化钠溶液配制成2 mg·mL-1水溶液,灌胃剂量为1 mL·(100 g)-1]。活血消瘿片低、中、高剂量组同时分别灌服活血消瘿片水溶液(将活血消瘿片用0.9%氯化钠溶液分别配制成4.4,8.8,17.6 g·mL-1水溶液,每日灌胃剂量为1 mL·kg-1)4.4,8.8,17.6 g·kg-1·d-1;左甲状腺素钠组大鼠同时灌以左甲状腺素钠片[8](将左甲状腺素钠用0.9%氯化钠溶液分别配制成7.8 μg·mL-1溶液,每日灌胃剂量为1 mL·kg-1),7.8 μg·kg-1·d-1,连续60 d。末次给药前1 d禁食不禁水。末次给药后1 h颈总动脉取血处死动物,留取血清和相关组织备检。

1.5 指标检测

1.5.1 脏器指数 迅速钝性剥离甲状腺组织和垂体,滤纸吸尽液体,精密称质量,计算脏器指数(脏器指数=脏器质量/体质量)。

1.5.2 血清FT3、FT4、TSH测定 采用化学发光法,照说明书进行。

1.5.3 病理检查 甲状腺组织和垂体用4%多聚甲醛固定,石蜡包埋,切片,脱蜡染色后脱水封固。

1.5.4 甲状腺组织bFGF、Bcl-2和TGF-β的表达 按常规进行免疫荧光制片,4'6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)显色。组织切片做完免疫荧光后用抗荧光淬灭封片剂封片,然后于倒置荧光显微镜下观察摄影。各组中每张切片随机挑选至少3个200倍视野进行摄影。应用Image-ProPlus16.0对照片进行分析,得出其阳性累积吸光度值。

2 结果

2.1 活血消瘿片对大鼠甲状腺、垂体组织质量的影响结果见表1。与正常对照组比较,模型对照组甲状腺指数明显增大,表明甲状腺肿模型造模成功;与模型对照组比较,活血消瘿片低、中、高剂量组大鼠甲状腺指数均显著降低,垂体指数均差异无统计学意义,提示活血消瘿片可明显缩小肿大的甲状腺。

2.2 活血消瘿片对大鼠血清FT3、FT4、TSH的影响结果见表2。与正常对照组比较,模型对照组FT3、FT4明显降低,TSH明显升高,表明模型成功。与模型对照组相比,活血消瘿片低、中、高剂量组FT3、FT4均有升高趋势,TSH均有降低趋势,但差异无统计学意义。左甲状腺素钠组FT3、FT4明显升高,TSH明显降低。结果显示,活血消瘿片对甲状腺激素影响不明显。

2.3 活血消瘿片对大鼠甲状腺组织的影响 肉眼观察可见,正常对照组大鼠甲状腺呈淡红色扁平状,难见到峡部,模型对照组大鼠甲状腺明显充血肿大,为绛紫色梭锤状,质较坚硬,峡部明显可见,易与其他组织剥离开来。活血消瘿片各剂量组颜色较模型对照组浅,质地较软。

苏木精-伊红(hematoxylin and eosin,HE)染色(图1)可见,正常对照组甲状腺内有大量圆形或椭圆形甲状腺滤泡,滤泡壁由单层上皮围成,形成双层壁,上皮细胞呈矮立方形。少量的间质,滤泡腔内含有淡红色胶状物,内含吸收空泡。模型对照组甲状腺滤泡增生,与正常对照组相比甲状腺滤泡上皮高度明显较高,甲状上皮细胞肥大增生,细胞由扁平变为立方形,部分呈柱状,腔内胶质少。活血消瘿片低、中、高剂量组甲状腺形态结构较模型对照组有较大改善,甲状腺滤泡恢复呈中等大小,上皮细胞呈立方或扁平状,滤泡腔内充满丰富的胶质。

表1 6组大鼠甲状腺及垂体质量与脏器指数测定结果Tab.1 Results of weight and organ index of thyroid and pituitary in six groups of rats ±s

表1 6组大鼠甲状腺及垂体质量与脏器指数测定结果Tab.1 Results of weight and organ index of thyroid and pituitary in six groups of rats ±s

与正常对照组比较,*1P＜0.01;与模型对照组比较,*2P＜0.05Compared with normal control group,*1P＜0.01;compared with model control group,*2P＜0.05

组别大鼠/只剂量/ (g·kg-1)甲状腺质量垂体质量mg甲状腺指数垂体指数(×10-6)正常对照组16…28.58±0.1822.27±0.31124.10±27.7993.43±51.68模型对照组160.02137.91±1.3819.26±0.19677.35±164.14*194.35±44.20活血消瘿片低剂量组164.4136.88±0.4715.95±0.01581.48±106.34*269.18±18.30中剂量组168.8128.26±2.2518.74±0.01522.99±21.53*2112.26±16.88高剂量组1617.6133.22±2.4520.55±0.19552.31±21.37*286.47±35.24左甲状腺素钠组160.02159.41±0.9424.91±0.28582.73±50.42*287.24±25.27

表2 6组大鼠血清FT3、FT4、TSH含量测定结果Tab.2 Determination results of the serumlevels of FT3,FT4and TSH in six groups of rats ±s

表2 6组大鼠血清FT3、FT4、TSH含量测定结果Tab.2 Determination results of the serumlevels of FT3,FT4and TSH in six groups of rats ±s

与正常组比较,*1P＜0.05;与模型对照组比较,*2P＜0.05Compared with normal control group,*1P＜0.05;compared with model control group,*2P＜0.05

组别大鼠/只剂量/ (g·kg1) FT3FT4(pg·mL-1) TSH/ (μU·mL-1)正常对照组16…2.04±0.1719.1±0.90.01±0.01模型对照组160.020.44±0.07*11.3±0.3*10.31±0.03*1活血消瘿片低剂量组164.40.62±0.061.5±0.10.21±0.03中剂量组168.80.51±0.081.6±0.10.19±0.02高剂量组1617.60.62±0.051.6±0.10.19±0.02左甲状腺素钠组160.021.19±0.04*221.0±0.3*20.10±0.01*2

2.4 活血消瘿片对丙基硫氧嘧啶致大鼠甲状腺肿模型甲状腺Bcl-2、bFGF及TGF-β表达的影响 见表3。与正常对照组比较,模型对照组Bcl-2、bFGF表达明显增高,TGF-β表达明显降低;与模型对照组比较,活血消瘿片低、中、高剂量组和左甲状腺素钠组Bcl-2、bFGF表达明显降低,TGF-β表达明显升高(图2～4)。

3 讨论

笔者在本研究中采用的丙硫氧嘧啶致大鼠甲状腺肥大是一种经典的甲状腺肿模型,丙硫氧嘧啶通过抑制过氧化物酶,减少碘的氧化和酪氨酸碘化及碘化酪氨酸缩合而抑制甲状腺激素的合成。另外,丙硫氧嘧啶还能抑制T4转变为T3,致使血清之中较强活性的T3含量明显快速降低。由于T3、T4水平降低,通过负反馈调节作用,促进垂体分泌TSH,从而导致甲状腺增生肥大——这种模型与人类甲状腺结节有一定的区别。本实验结果表明,活血消瘿片能够降低模型大鼠甲状腺指数,具有一定的消肿作用。活血消瘿片虽然有升高FT3、FT4,降低TSH的作用趋势,但差异无统计学意义,说明活血消瘿片对甲状腺激素生成与降解的影响较小,其缩小甲状腺的作用与促进FT3、FT4合成可能无关,其治疗NG时不影响甲状腺生理功能是其优点。

表3 6组大鼠Bcl-2、bFGF与TGF-β测定结果Tab.3 Determination results of Bcl-2、bFGF and TGF-β in six groups of rats ±s

表3 6组大鼠Bcl-2、bFGF与TGF-β测定结果Tab.3 Determination results of Bcl-2、bFGF and TGF-β in six groups of rats ±s

与正常对照组比较,*1P＜0.01;与模型对照组比较,*2P＜0.01Compared with normal control group,*1P＜0.01;compared with model control group,*2P＜0.01

组别Bcl-2bFGFTGF-β正常对照组108±3306 941±810模型对照组59 795±901*11 456±127*1269±161*1活血消瘿片低剂量组2 259±418*2325±181*21 608±298*2中剂量组2 086±184*2239±64*21 864±215*2高剂量组1 924±259*2219±87*22 053±367*2左甲状腺素钠组1 579±50*2200±49*22 100±335*2

A.正常对照组;B.模型对照组;C.活血消瘿片低剂量组;D.活血消瘿片中剂量组;E.活血消瘿片高剂量组;F.左甲状腺素钠组图1 6组大鼠甲状腺组织病理检查结果(HE,×100)A.normal control group;B.model control group;C.low-dose huoxuexiaoying tablet group;D.medium-dose huoxuexiaoying tablet group;E.high-dose huoxuexiaoying tablet group;F.euthyrox groupFig.1 Pathological results of thyroid in six groups of rats(HE,×100)

A.正常对照组;B.模型对照组;C.活血消瘿片低剂量组;D.活血消瘿片中剂量组;E.活血消瘿片高剂量组;F.左甲状腺素钠组图2 6组大鼠甲状腺组织Bcl-2表达结果(×200)A.normal control group;B.model control group;C.low-dose huoxuexiaoying tablet group;D.medium-dose huoxuexiaoying tablet group;E.high-dose huoxuexiaoying tablet group;F.euthyrox groupFig.2 Bcl-2 expression of thyroid in six groups of rats(×200)

A.正常对照组;B.模型对照组;C.活血消瘿片低剂量组;D.活血消瘿片中剂量组;E.活血消瘿片高剂量组;F.左甲状腺素钠组图3 6组大鼠甲状腺组织bFGF表达结果(×200)A.normal control group;B.model control group;C.low-dose huoxuexiaoying tablet group;D.medium-dose huoxuexiaoying tablet group;E.high-dose huoxuexiaoying tablet group;F.euthyrox groupFig.3 bFGF expression of thyroid in six groups of rats(×200)

A.正常对照组;B.模型对照组;C.活血消瘿片低剂量组;D.活血消瘿片中剂量组;E.活血消瘿片高剂量组;F.左甲状腺素钠组图4 6组大鼠甲状腺组织TGF-β表达结果(×200)A.normal control group;B.model control group;C.low-dose huoxuexiaoying tablet group;D.medium-dose huoxuexiaoying tablet group;E.high-dose huoxuexiaoying tablet group;F.euthyrox groupFig.4 TGF-β expression of thyroid in six groups of rats(×200)

bFGF为含155个氨基酸的阳离子多肽,是重要的促有丝分裂因子,也是形态发生和分化的诱导因子,其生理作用包括促进创伤愈合与组织修复、促进组织再生等,是促进细胞生长的调控因子之一,通过与靶细胞上的受体结合而发挥作用,能够刺激甲状腺滤泡细胞不断增生及分化。Bcl-2是调控细胞凋亡的主要因子之一,通过调节其与细胞中bax蛋白质结合构成不同的二聚体比例来抑制细胞凋亡,延长细胞生存期,促进细胞增殖[9]。TGF-β在炎症、组织修复和胚胎发育方面具有重要的生理功能,对细胞的生长、分化和免疫功能也有重要的调节作用。其机制与促进细胞外基质(extracellular matrixc,ECM)如胶原蛋白、纤粘连蛋白的表达和抑制ECM的降解,对细胞的形态发生、增殖和分化过程起着重要作用。在甲状腺肿主要通过甲状腺滤泡上皮细胞增生,能够抑制其增殖并维持甲状腺滤泡上皮细胞的正常形态[10]。实验结果显示,活血消瘿片可以使甲状腺肿大大鼠的bFGF及Bcl-2表达明显降低,TGF-β表达升高,说明活血消瘿片抗甲状腺肿的作用可能与抑制甲状腺组织的增生、促进其分化有关。其完整作用的机制有待进一步研究。

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DOI 10.3870/yydb.2014.07.004

Effects of Huoxuexiaoying Tablet on the Goiter Model of Rats

TIAN Xian-xiang,WANG Rui,PAN Jian-ying,WU Yong,LU Yun,ZHENG Guo-hua
(College of Pharmacy, Hubei University of Chinese Medicine,Wuhan 430065,China)

ObjectiveTo investigate the effects and mechanismofhuoxuexiaoyingtablet on experimental goiter of rats.MethodsThe rats were randomly divided into six groups:the control,the model control group,huoxuexiaoyingtablet at different doses,and the sodiumlevothyroxine group(Euthyrox group).Except for the rats in the control,the rats in other groups were given with propylthiouracil(20 mg·kg-1·d-1)by intragastric(i.g.)administration every day for 60 days.Meanwhile, some rats were treated withhuoxuexiaoyingtablet at low(4.4 g·kg-1·d-1),middle(8.8 g·kg-1·d-1)and high dose(17. 6 g·kg-1·d-1)orally,and those in the Euthyrox group were given with 7.8 μg·kg-1·d-1Euthyrox by i.g.administration.The rats in the control group were administrated with the same volume of saline(N.S).After 60 days of treatment,the rats were sacrificed,the organ indexes of thyroid and pituitary and the levels of free triiodothyronine(FT3)、free thyroxin(FT4)and thyroid stimulating hormone(TSH)in serum,were tested.The expression of basic fibroblast growth factor(bFGF),transforming growth factor-β(TGF-β)and B-cell lymphoma 2 gene(Bcl-2)were examined by immunofluorescence.ResultsCompared with the model,organ indexes of thyroid were significantly reduced byhuoxuexiaoyingtablet at three doses(P＜0.05),but not for the pituitary(P＞0.05).The levels of FT3and FT4were in a elevating trend,but TSH decreased with no significance(P＞0.05).The morphological structure of thyroid was greatly improved byhuoxuexiaoyingtablet in comparison with the model.In which the gland dilated,thyroid follicular restored to moderate size,epithelia were cubic or flattened and follicular cavity filled with abundant glial.The expression of bFGF and Bcl-2 decreased significantly(P＜0.01)while TGF-β expression increased notably(P＜0.01).ConclusionHuoxuexiaoyingtablet has a great anti-goiter effect,the mechanismof which may be related to promoting thyroid cells apoptosis and inhibiting thyroid cells proliferation.

Huoxuexiaoyingtablet;Goiter;Pharmacodynamics;Immunofluorescence

R286;R965

A

1004-0781(2014)07-0853-05

2013-09-02

2013-10-10

*2010年湖北省教育厅重点项目(D20101804)

田先翔(1971-),男,湖北仙桃人,副教授,硕士生导师,博士,主要从事中药药理学研究。电话:027-68890137,E-mail:doctortxx@aliyun.com。

郑国华(1964-),男,天津人,教授,博士生导师,博士,主要从事中药新制剂与新剂型的研究。电话:027-68890113,E-mail:zgh1227@sina.com。