恰麻古中总黄酮提取工艺*

海力茜·陶尔大洪，古娜娜·对山别克

(新疆医科大学药学院，乌鲁木齐 830054)

维药恰麻古，又称为芜菁(Brassica rapaL.)，为十字花科植物芜菁(Brassica rapaL.)的块根。恰麻古在维吾尔医药中应用历史悠久，疗效肯定。据《维吾尔药志》记载，该药具有润肺、开胸顺气、健胃消食、解毒的功效。用于胸闷腹胃胀痛、食欲不振等症［1］。初步实验研究发现，恰麻古药材中含有皂苷、黄酮类、糖类及其苷、生物碱、内酯、挥发油、酚类、鞣质、氨基酸、蛋白质等化学成分［2］。黄酮类化合物具有降低血糖、保护心脑血管、利胆保肝、抗炎、抗氧化等多种功效［3-4］。为合理开发利用资源，笔者采用回流提取和紫外-可见分光光度法优选出恰麻古中总黄酮的最佳提取工艺，并对不同产地恰麻古中总黄酮的含量进行测定。

1 仪器与试药

1.1 仪器 UV-1102紫外分光光度计(上海天美科学仪器有限公司)，超声波清洗机(200 W，40 kHz，昆山市超声仪器有限公司)，万能粉碎机(北京中兴伟业仪器有限公司)，分析天平(Mettler-Teledo，AB135-S，d=0.01/0.1 mg)，RE-52型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)。

1.2 试药 恰麻古采自新疆阿克苏、喀什、托克逊、伊犁、博乐，秋季采摘，由新疆医科大学药学院生药/天药教研室帕丽达·阿不力孜教授鉴定为十字花科植物芜菁(Brassica rapaL.)的块根。芦丁对照品(批号:0080-9705)由中国食品药品检定研究院提供，纯化水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的制备 称取恰麻古样品1.0 g，加入75%乙醇50mL，于80℃水浴中回流提取2.5 h，将提取溶液浓缩置于50mL量瓶并定容摇匀，作为供试品溶液。

2.2 对照品溶液的制备 取芦丁对照品10.00 mg精确称定，置50mL量瓶中，加入60%乙醇30mL，放在水浴上微热，使芦丁完全溶解，并用60%乙醇溶液定容，摇匀，得 0.200 mg·mL－1的芦丁对照品溶液。

2.3 测定波长的选择 分别取对照品和供试品溶液，按“2.4”项标准曲线的绘制方法显色，于400～600 nm波长范围扫描，确定510 nm为最大吸收波长。

2.4 标准曲线的绘制 准确量取芦丁对照品溶液0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0mL，分别置于 25mL量瓶，各依次加入5%亚硝酸钠溶液1mL，振摇后放置5min，加入10%硝酸铝溶液1mL，摇匀后放置6min，加4%氢氧化钠溶液10mL，最后用60%乙醇定容至刻度，以60%乙醇作为空白对照，在510 nm波长处测定吸光度，以芦丁对照品溶液浓度(C)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标，得到芦丁对照品溶液浓度与吸光度之间的回归方程A=13.364C－0.008 6(浓度范围为0.008 ～0.048 mg·mL－1)，r=0.999 3，表明线性关系良好。

2.5 精密度实验 精密量取芦丁标准品溶液3.0mL，置25mL量瓶，按“2.4”项显色处理并定容后于510 nm波长处重复测定吸光度6次，RSD=0.022%(n=6)，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性实验 准确吸取供试品溶液5mL，共6份，置于25mL量瓶，按“2.4”项显色处理后于 0，10，30，60，90min时在510 nm波长处测定吸光度，考察其显色后的稳定性，得稳定性实验的RSD=1.311%(n=6)，供试品溶液40min内总黄酮的含量稳定，须在40min内尽快测定吸光度。

2.7 重复性实验 取干燥的恰麻古粉末1.0 g准确称定，共5份，按“2.1”项平行实验，按“2.4”项方法显色，在510 nm波长测定吸光度，结果RSD为1.601%。

2.8 加样回收率实验 取已知总黄酮含量的供试品溶液9份各2mL，置200mL量瓶，按低、中、高浓度分别加入芦丁对照品 1.5，1.5，1.5，3.0，3.0，3.0，4.5，4.5，4.5 mg，定容至刻度。按“2.4”项显色处理后于510 nm波长处测定吸光度。结果表明，平均加样回收率为99.59%，RSD=0.376%(n=9)。见表1。

2.9 恰麻古总黄酮的提取及含量测定 取干燥的恰麻古粉末1.000 g精密称定，置于圆底烧瓶，综合考察提取温度、乙醇浓度、提取时间和料液比4个因素，每个因素分别设计3个不同水平，采用L9(34)正交表进行实验筛选，实验因素水平表见表2。

将提取溶液浓缩置于50mL量瓶并定容摇匀，按“2.4”项显色并在510 nm波长处测定吸光度，根据标准曲线计算总黄酮的浓度，即得(表3)。

表1 加样回收率实验结果Tab.1 Result of recovery

表2 正交实验设计Tab.2 Design of orthogonal experiment

表3 正交实验数据分析表Tab.3 Data analysis of orthogonal experiment

为了确定显著性因子，对表2进行方差分析和显著性检验，结果见表4。

2.10 最佳条件的选择 通过方差分析表可知，A、B、C、D因素均P＜0.01，差异有统计学意义，按平均方差大小排列，各因素对实验的影响大小为D＞B＞A＞C，该结果与直观分析的结果一致，最优条件为:乙醇浓度75%，提取时间2.5 h，提取温度80℃，料液比1∶60。

2.11 工艺验证实验 精密称取6份干燥的恰麻古粉末，每份1.000 g，按最佳工艺提取，按“2.4”项显色处理后于510 nm波长处测定吸光度，结果3次测定提取溶液中黄酮含量分别为0.034 00，0.033 86，0.033 89 ng·mL－1。求得RSD=0.187%(n=6)，表明所选工艺合理可行。

表4 正交实验结果的方差分析Tab.4 Variance analysis of orthogonal experiment

2.12 不同产地恰麻古总黄酮的含量测定 根据最佳提取工艺对阿克苏、喀什、托克逊、伊犁、博乐这5个不同产地的恰麻古的总黄酮进行含量测定，结果总黄酮含量分别为 0.280% ，0.261%，0.237%，0.257%，0.264%。

3 讨论

本实验以回流提取法提取和紫外可见分光光度法测定恰麻古中黄酮含量，通过正交实验优选出最佳提取工艺为:乙醇浓度75%，提取时间2.5 h，提取温度80℃，料液比1∶60。根据最佳工艺，提取并测定了新疆5个产地恰麻古中总黄酮的含量，结果表明，不同产地的恰麻古其总黄酮的含量有差异，其中阿克苏产恰麻古中总黄酮含量最高。本实验采用紫外可见分光光度法测定总黄酮含量的重复性、稳定性能够符合要求，方法简单易行，适用于恰麻古中总黄酮含量的测定。

［1］刘勇民.维吾尔药志(下册)［M］.乌鲁木齐:新疆科学技术出版社，1996:334－335.

［2］周芳，海力茜·陶尔大洪.维药恰麻古化学成分预实验［J］.海峡药学，2009，21(6):100－102.

［3］李茂星.镰形棘豆黄酮类成分提取工艺与体外抗氧化活性研究［J］.医药导报，2012，31(9):1195－1199.

［4］宋成英，黄俊懿.对生物黄酮生物活性的综述［J］.化学工程与装备，2013，(4):128－130.