反相高效液相色谱法同时测定无比山药丸中3种活性成分含量

王鑫昱，陈红梅，吴敏

(浙江中医药大学附属广兴医院中药房，杭州 310006)

无比山药丸中山茱萸和五味子具有抗炎、抗氧化、抗衰老、抗休克、保护肝脏、降血糖和调节人体免疫力等作用［1-10］，无比山药丸主要活性成分为腺苷、马钱苷、五味子醇甲等。对于该制剂，原质量标准收载于《中药部颁标准》第九分册，但仅有理化鉴别，无含量检测。为了更好地控制该制剂质量，笔者在本实验中建立反相高效液相色谱(RP-HPLC)法同时对上述3种活性成分进行含量测定。

1 仪器与试药

1.1 仪器 HP-1100美国Agilent高效液相色谱仪(美国Agilent公司);Agilent 1100系列柱温箱;Agilent 1100可变波长检测器;Aglient 1100系列泵系统;pa2251电子分析天平(德国赛多利斯);Centrifuge 5430R型高速离心机(USA，Eppendorf);4020P超声波清洗器(Korea，JAC Company)。

1.2 试药 腺苷、马钱苷和五味子醇甲对照品(中国食品药品检定研究院，批号分别为110879-200202，111640-201005，110857-200709，使用前用五氧化二磷干燥12 h，均按照100%计算，含量分别为8.92 mg，10.11 mg，6.13 mg);无比山药丸(杭州胡庆余堂药业有限公司，每丸9 g，批号:120911，121032和130104);甲醇为色谱纯;水为Mili-Q纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱:Agilent Zorbax-C18柱(4.6mm ×250mm，5 μm);流动相为甲醇(A)-0.1%磷酸溶液，流速为1.0mL·min－1;检测波长254 nm;柱温:35℃;梯度洗脱条件:0～15min，8%A;15～26min，25%A;26 ～40min，70%A。

2.2 混合对照品溶液的配制 分别取五氧化二磷为干燥剂减压干燥12 h以上的腺苷、马钱苷和五味子醇甲对照品适量，精密称定，置量瓶中，用50%甲醇定容成浓度分别为 0.603，0.575，0.081 5 mg·mL－1对照品储备液，分别精密量取各储备液1.0，1.0和2.0mL至10mL量瓶，以50%甲醇定容至刻度即得。

2.3 供试品溶液的制备 取供试品15丸(批号:120911)，研细，取约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶，精密量取50%甲醇50mL，称定质量后，超声处理40min，冷却至室温，再次称定质量，用50%甲醇补足失重，摇匀，高速离心10min，取上清液作为供试品液。

2.4 阴性对照溶液的制备 按照无比山药丸处方，取除山茱萸和五味子两味药材之外的其他药材适量，按药品标准中“制法”项下进行制备，得不含山茱萸和五味子成分的阴性对照溶液，再按“2.3”项下制备，得阴性对照品溶液。

2.5 线性关系考察 分别精密吸取上述对照品混合液1，2，5，10，15，20，30 μL，依次注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件进样分析，测定峰面积，以峰面积积分值为纵坐标，以进样量(μg)为横坐标进行线性回归，得回归方程见表1。结果表明，腺苷、马钱苷和五味子醇甲在各自的线性范围内，其峰面积积分与进样量呈良好的线性关系。

表1 3种活性成分回归方程和线性范围

2.6 精密度实验 精密吸取同一对照品溶液10 μL，连续进样6次，分别测得腺苷、马钱苷和五味子醇甲的峰面积积分值，以峰面积积分值计算3种活性成分的RSD(n=6)，分别为 0.4%，0.1% 和 0.7%，表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性实验 取同一供试品溶液(批号:120911)，分别在 0，2，4，8，12，16，24 h 进样，记录峰面积积分值，测得腺苷、马钱苷和五味子醇甲峰面积的RSD 分别为1.1%，1.6%和1.9%，表明供试品溶液在24 h内稳定性较好。

2.8 重复性实验 精密称取同一批号供试品(批号:120911)，按供试品溶液制备方法(“2.3”项)同法制得6份供试品溶液，各进样10 μL，根据供试品中腺苷、马钱苷和五味子醇甲各自的峰面积值，计算得到3种活性成分各自的RSD值，依次为1.2%，1.5%和1.3%。结果表明本方法重复性较好(图1)。

图1 阴性对照品(A)、混合对照品(B)和无比山药丸样品(C)的RP-HPLC图谱

2.9 加样回收率实验 取已知含量的同一批供试品15丸，研细，取约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入各对照品储备液适量，按“2.3”项供试品溶液制备方法操作，同法制得6份供试品溶液。按“2.1”项条件方法进行测定，根据测得的峰面积积分值分别计算腺苷、马钱苷和五味子醇甲的回收率。计算得平均加样回收率分别为98.44%，98.84%和96.79%，RSD分别为1.2%，2.0%和1.7%，结果表明本方法的加样回收率较好，符合方法学要求(表2)。

2.10 样品含量测定 利用本实验建立的RP-HPLC方法，测定同一厂家3个不同批号的无比山药丸。以外标法计算样品中腺苷、马钱苷和五味子醇甲的含量，结果见表3。

3 讨论

3.1 样品前处理方法的选择 在选择提取方法时，考察了提取溶剂(甲醇、50%甲醇、水)，提取方式(超声、回流)以及提取时间(30，40，50min)对提取效率的影响。结果表明，50%甲醇超声提取40min为最优提取方案。

表2 腺苷、马钱苷、五味子醇甲加样回收率实验结果mg

表3 无比山药丸3批样品含量测定结果 mg·g－1

3.2 流动相的选择 实验前分别考察了以甲醇-磷酸、甲醇-水、乙腈-磷酸和乙腈水作为流动相的分离效果，结果显示以甲醇-水溶液为流动相的峰形无重叠，分离度较好。在综合考虑峰形、拖尾因子、保留时间、理塔板数等因素，最终选择甲醇-磷酸溶液进行梯度洗脱。

3.3 色谱柱和柱温的选择 在色谱柱选择方面，分别比较了 Eclipse-C18、Extend-C18、Zorbax SB-C18、Hypersil-C18、Kromasil 100-5C18和 Welch Material XB-C18柱对峰形、保留时间的影响，同时还考察柱温分别在25，35和45℃时，3种色谱峰的分离效果。结果表明，Zorbox SB-C18柱的分离效果最好，柱温35℃为佳。

在本法的色谱条件下，无比山药丸中3种活性成分得到较好分离。经方法学验证，该方法快速简便，精密度高，重复性和稳定性好，可用于无比山药丸中腺苷、马钱苷和五味子醇甲的定量分析，为该药的质量控制提供了一种良好的监测方法。

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