菝葜不同浓度乙醇提取物的抗炎活性筛选*

罗艳琴,马云,宋路瑶,秦飞,范银洲,侯连兵

(1.南方医科大学南方医院药学部,广州 510515;2.南方医科大学药学院,广州 510515)

菝葜不同浓度乙醇提取物的抗炎活性筛选*

罗艳琴1,马云1,宋路瑶1,秦飞1,范银洲2,侯连兵1

(1.南方医科大学南方医院药学部,广州 510515;2.南方医科大学药学院,广州 510515)

目的 研究菝葜不同浓度乙醇提取物治疗小鼠耳肿胀模型和大鼠棉球肉芽肿模型的药理作用,为确定菝葜最佳提取工艺提供参考。方法采用不同浓度乙醇制备菝葜提取物,观察其对二甲苯致小鼠耳肿胀模型和大鼠棉球肉芽增生的影响。结果与模型对照组比较,高、中、低剂量菝葜70%乙醇提取物对小鼠耳肿胀度有显著的抑制作用(t=2.58,P＜0.05;t=2.28,P＜0.05;t=2.17,P＜0.05),可明显降低大鼠棉球肉芽肿增生(t=5.28,P＜0.01;t=5.24,P＜0.01;t=5.17,P＜0.01)。结论小鼠耳肿胀和大鼠棉球肉芽肿两种模型证实,菝葜70%乙醇提取物各剂量组的抗炎活性作用最好。

菝葜;乙醇提取物;肿胀,耳;肉芽肿

菝葜又名金刚藤,为百合科植物菝葜(Smilax china L.)的干燥根茎,其味酸、甘,性平,具有祛风利湿、解毒散瘀的功效[1]。研究发现,菝葜具有抗炎镇痛、活血化瘀、免疫抑制、抗菌、抗肿瘤等药理作用[2]。目前对菝葜提取物抗炎作用的报道多见于菝葜水煎液[3],菝葜50%,80%乙醇提取物[4],以及菝葜95%乙醇提取物[5]的抗炎药理作用,常采用水提醇沉法[6]。而且对菝葜不同浓度乙醇提取物的最佳提取工艺的筛选研究多停留在正交设计含量测定阶段[7-9],笔者未见菝葜不同浓度乙醇提取物抗炎疗效的药效学比较研究。笔者在本研究中通过比较菝葜不同浓度乙醇回流提取物对小鼠耳肿胀模型和大鼠棉球肉芽肿模型的抗炎作用实验,以期从抗炎药效角度确立菝葜在现代中药制剂中的最佳提取乙醇浓度,为进一步研究菝葜提取、分离、纯化工艺提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物 无特定病原体(specefic pathogen free, SPF)级斯泼累格·多雷(Sprague Dawley,SD)大鼠170只,雌性,体质量180～220 g,由南方医科大学实验动物中心提供,生产许可证号:SCXK(粤)2011-0015,合格证号:No.4402101912。SPF级昆明小鼠255只,雌性,体质量18～22 g,由南方医科大学实验动物中心提供,生产许可证号:SCXK(粤)2011-0015,合格证号: No.44002100000209。实验前将动物置室内适应性饲养3 d,室温18～22℃,相对湿度50%～70%。

1.2 药物与试剂 菝葜由湖北省药材公司提供,经南方医科大学中医药学院刘传明教授鉴定为百合科植物菝葜的根茎。金刚藤胶囊(湖北福人药业股份有限公司,批号:20110318)。二甲苯(广东光华科技股份有限公司,批号:20111225),戊巴比妥钠(Merck公司,批号:1212013),注射用头孢美唑钠(DAEWOONG公司,批号:064065)。

1.3 仪器 KH-500B超声波清洗器(昆山禾木创超声仪器有限公司),升降恒温水油浴锅(巩义市予华仪器有限责任公司),RE旋转蒸发器(巩义市予华仪器有限责任公司),D2F-6050真空干燥箱(巩义市英峪予华仪器厂),HH-S6数显恒温水浴锅(金坛市医疗仪器厂),YP10002型电子天平(上海佑科仪器仪表有限公司),BA110S型电子分析天平(万分之一精确度,德国Sartorius),微量加样器(Eppendorf公司),GZX-DH电热恒温干燥箱(上海跃进医疗器械厂)。

1.4 菝葜不同浓度乙醇提取物受试药物的制备

1.4.1 菝葜水提取物 取菝葜药材,粉碎后过筛孔内径0.15 mm筛(100目)备用,称取粗粉1 000 g,加8倍量水提取2 h,5倍量水提取2 h,5倍量水再提取1 h,合并滤液,静置过夜,滤过,50～60℃减压浓缩得浸膏,每克浸膏相当于原药材21.22 g。

1.4.2 菝葜30%乙醇提取物 称取菝葜粉碎备用粗粉1 000 g,30%乙醇用量为8,5,5倍,提取时间为2, 2,1 h。合并3次滤液,50～60℃减压浓缩至无醇味,得浸膏,每克浸膏相当于原药材50.46 g。

1.4.3 菝葜50%乙醇提取物 称取菝葜粉碎备用粗粉1 000 g,50%乙醇用量为8,5,5倍,提取时间为2, 2,1 h。合并3次滤液,50～60℃减压浓缩至无醇味,得浸膏,每克浸膏相当于原药材51.38 g。

1.4.4 菝葜70%乙醇提取物 称取菝葜粉碎备用粗粉1 000 g,70%乙醇用量为8,5,5倍,提取时间为2, 2,1 h。合并3次滤液,50～60℃减压浓缩至无醇味,得浸膏,每克浸膏相当于原药材51.56 g。

1.4.5 菝葜95%乙醇提取物 称取菝葜粉碎备用粗粉1 000 g,95%乙醇用量为8,5,5倍,提取时间为2, 2,1 h。合并3次滤液,50～60℃减压浓缩至无醇味,得浸膏,每克浸膏相当于原药材50.84 g。

1.5 二甲苯致小鼠耳廓肿胀模型实验

1.5.1 模型的制备 取雌性昆明小鼠,连续给药3 d,于第4天灌胃给药30 min后,以移液枪将二甲苯涂于小鼠右耳前后两面各0.015 mL,每鼠右耳共0.03 mL;左耳做空白对照。20 min后处死小鼠,从耳廓基部剪下双耳,并以直径8 mm打孔器分别沿左右耳缘正中相同部位等面积打下两圆形耳片,称质量[10]。

1.5.2 分组及给药 将255只雌性昆明小鼠采用完全随机分组方法分为17组:菝葜水提取物,30%, 50%,70%,95%乙醇提取物的高、中、低剂量组均分别灌胃给予46.8,23.4,11.7 g·kg-1药物(按生药量计,即相当于临床等效剂量的4,2,1倍);金刚藤胶囊组以生药量计23.4 g·kg-1,灌胃给予小鼠,相当于临床用量的2倍;模型对照组给予等体积纯化水。每天1次,连续给药3 d。

1.5.3 观察指标 用电子天平(精确度为万分之一)准确称左、右耳朵片质量,计算耳肿胀度;小鼠处死后,腹部正中切开,立即摘取脾脏称质量,计算脏器指数。计算公式:耳肿胀度=右耳朵片质量-左耳朵片质量;脾脏指数(%)=(脾脏质量/小鼠体质量)×100%。

1.6 大鼠棉球肉芽肿模型实验

1.6.1 模型的制备 取SD雌性大鼠,禁食不禁水12 h,3%戊巴比妥钠(30 mg·kg-1)腹腔麻醉,剪除其下腹中部毛,以酒精消毒,在腹部正中切开1 cm开口,从切口向左侧腹股沟塞入灭菌棉球1个[棉球质量(50±1)mg,临用前用注射器注入1 mg·(0.1 mL)-1头孢美唑钠],缝合腹壁皮肤,安尔碘皮肤消毒剂消毒术区[11]。

1.6.2 分组及给药 将清醒后的雌性SD大鼠随机分为17组:菝葜水提取物,30%,50%,70%,95%乙醇提取物的高、中、低剂量组均分别灌胃给予32.4,16. 2,8.1 g·kg-1药物(按生药量计,即相当于临床等效剂量的4,2,1倍);金刚藤胶囊组以生药量计16.2 g·kg-1灌胃给药(相当于临床等效剂量的2倍);模型对照组给予等体积纯化水。每天1次,连续给药7 d。

1.6.3 观察指标 于给药后第8天,3%戊巴比妥钠腹腔麻醉,从原切口将棉球连同周围增生的结缔组织一起取出,剔除脂肪组织,恒温干燥箱60℃放置24 h后,用电子天平精密称质量,减去棉球原质量即得肉芽肿质量。因动物摄食量的降低或体质量减轻亦可降低肉芽肿质量,故应按mg(肉芽肿)·(100 g)-1(体质量)表示[12]。计算公式:肉芽肿净质量=(棉球肉芽肿质量-植入棉球质量)/7 d后大鼠的体质量;肉芽肿抑制率(%)=(模型对照组肉芽肿平均净质量-给药组肉芽肿平均净质量)/模型对照组肉芽肿平均净质量×100%。

1.7 统计学方法 所有数据均采用SPSS16.0版软件进行统计。计量资料统计结果用均数±标准差(±s)表示,完全随机设计资料的多个样本均数比较采用单因素方差分析,组间两两比较,方差齐时采用LSD检验,方差不齐时采用Dunnett's T3检验,P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 二甲苯致小鼠耳廓肿胀模型实验结果 以二甲苯涂抹小鼠右耳正、反面20 min后,小鼠右耳充血肿胀明显。由表1可知,与模型对照组比较,金刚藤胶囊组小鼠耳肿胀程度显著改善(t=2.05,P＜0.05);70%乙醇提取物高剂量组(t=2.58,P＜0.05),中剂量组(t=2.28, P＜0.05),低剂量组(t=2.17,P＜0.05)小鼠耳肿胀被明显抑制;菝葜水提取物高剂量组(t=-0.35,P＞0.05)、中剂量组(t=-0.13,P＞0.05)、低剂量组(t=-0.32,P＞0.05),30%乙醇提取物的高剂量组(t=1.37,P＞0.05)、中剂量组(t=0.60,P＞0.05)、低剂量组(t=0.24,P＞0.05),50%乙醇提取物的高剂量组(t=1.67,P＞0.05)、中剂量组(t=1.27,P＞0.05)、低剂量组(t=1.01,P＞0.05),95%乙醇提取物的高剂量组(t=1.52,P＞0.05)、中剂量组(t=1.60,P＞0.05)、低剂量组(t=1.49,P＞0.05)小鼠耳肿胀均未被明显抑制。提示菝葜70%乙醇提取物抗炎活性作用最好。

肉眼观察发现,模型对照组小鼠脾脏明显肿大。与模型对照组比较,金刚藤胶囊组(t=1.99,P＜0.05),30%乙醇提取物高剂量组(t=2.56,P＜0.05)、中剂量组(t=2.08,P＜0.05),50%乙醇提取物中剂量组(t=2.56,P＜0.05)、低剂量组(t=2.07,P＜0.05)和95%乙醇提取物低剂量组(t=2.49,P＜0.05)脾脏肿大均减少;50%乙醇提取物高剂量组(t=3.11,P＜0.01),70%乙醇提取物高剂量组(t=4.33,P＜0.01)、中剂量组(t=4.23,P＜0.01)、低剂量组(t=3.55,P＜0.01),95%乙醇提取物高剂量组(t=3.59,P＜0.01)、中剂量组(t=2.76,P＜0.01)脾脏肿大差异有统计意义;菝葜水提取物高剂量组(t=0.07,P＞0.05)、中剂量组(t=-0.15,P＞0.05)、低剂量组(t=-0.51,P＞0.05)和30%乙醇提取物低剂量组(t=1.53,P＞0.05)脾脏肿大被抑制不明显,差异无统计学意义。见表1。

2.2 大鼠棉球肉芽肿实验研究 与模型对照组比较,金刚藤胶囊组大鼠棉球肉芽肿增生(t=5.59,P＜0.01)明显降低,而30%,50%,70%,95%乙醇提取物高、中、低剂量组大鼠棉球肉芽肿增生均被不同程度抑制,其中30%乙醇提取物的高剂量组(t=2.61,P＜0.05)、中剂量组(t=2.65,P＜0.05)、低剂量组(t=2.44,P＜0.05)及95%乙醇提取物低剂量组(t=2.4,P＜0.05)差异有统计学意义;50%乙醇提取物的高剂量组(t=4.22,P＜0.01)、中剂量组(t=4.1,P＜0.01)、低剂量组(t=3.91,P＜0.01),70%乙醇提取物的高剂量组(t=5.28,P＜0.01)、中剂量组(t=5.24,P＜0.01)、低剂量组(t=5.17,P＜0.01)差异有统计学意义,95%乙醇提取物的高剂量组(t=2.89,P＜0.01)、中剂量组(t= 3.17,P＜0.01)差异有统计学意义;70%乙醇提取物各剂量组疗效均优于50%乙醇提取物各剂量组。说明70%乙醇提取物各剂量组对大鼠棉球肉芽肿增生的抑制作用最优。菝葜水提取物高剂量组(t=1.45,P＞0.05)、中剂量组(t=0.62,P＞0.05)、低剂量组(t= 0.04,P＞0.05)差异无统计学意义,见表2。

表1 菝葜不同溶剂提取物对二甲苯所致小鼠耳肿胀及脾脏指数的影响Tab.1 Effect of different solvent extracts of Smilax China on xylene-induced ear edema and spleen index in mice ±s

表1 菝葜不同溶剂提取物对二甲苯所致小鼠耳肿胀及脾脏指数的影响Tab.1 Effect of different solvent extracts of Smilax China on xylene-induced ear edema and spleen index in mice ±s

与模型对照组比较,*1P＜0.05,*2P＜0.01Compared with model control group,*1P＜0.05,*2P＜0.01

组别数量/只剂量/(g·kg-1)耳肿胀度/mg脾脏指数/%模型对照组15…5.98±3.820.40±0.12金刚藤胶囊组1523.43.62±2.66*10.34±0.07*1菝葜水提取物高剂量组1446.86.39±4.480.40±0.08中剂量组1323.46.14±3.140.40±0.08低剂量组1411.76.35±3.220.41±0.09菝葜30%乙醇提取物高剂量组1546.84.41±3.180.32±0.09*1中剂量组1523.45.29±3.750.34±0.06*1低剂量组1411.75.70±3.700.35±0.12菝葜50%乙醇提取物高剂量组1546.84.05±3.110.30±0.08*2中剂量组1423.44.49±2.920.32±0.05*1低剂量组1511.74.81±2.650.34±0.06*1菝葜70%乙醇提取物高剂量组1546.83.01±2.23*10.27±0.08*2中剂量组1523.43.35±2.77*10.27±0.05*2低剂量组1511.73.48±2.39*10.29±0.09*2菝葜95%乙醇提取物高剂量组1346.84.16±3.220.29±0.07*2中剂量组1523.44.13±3.220.31±0.09*2低剂量组1511.74.26±2.440.32±0.06*1

3 讨论

炎症通常可依病程经过分为急性炎症和慢性炎症。急性炎症起病急骤,持续时间短,仅几天到一个月,以渗出病变为其特征,炎症细胞浸润以粒细胞为主。慢性炎症持续时间较长,常数月到数年,以增生、病变为主,其炎症细胞浸润则以巨噬细胞和淋巴细胞为主[13]。小鼠耳肿胀模型是急性炎症模型的一种,常用二甲苯作为致炎剂来诱导小鼠耳肿胀,二甲苯局部刺激作用导致毛细血管通透性增高及渗出肿胀,引起急性炎症。近几年来,小鼠耳肿胀模型已发展成为一类比较成熟的动物炎症模型,由于其操作简单,模型稳定,常用来评价一些植物有效成分的抗炎活性[14]。大鼠棉球肉芽肿属慢性炎症模型,棉球肉芽肿病变以棉球为中心,周围有多量巨噬细胞、异物巨细胞、成纤维细胞和淋巴细胞等包绕,形成结节状病灶,引起慢性炎症。建立急性和慢性炎症两种经典动物模型,是研究菝葜不同浓度乙醇提取物的抗炎活性筛选的重要途径。

本实验比较了菝葜不同浓度乙醇提取物的抗炎活性作用。发现菝葜乙醇提取物在抑制小鼠耳肿胀度和大鼠棉球肉芽肿增生的炎症方面具有一定作用,表明菝葜制剂用于抗炎具备较好的药理学基础。对菝葜不同浓度乙醇提取物药理作用结果进行对比分析显示:在对抗小鼠耳朵肿胀和大鼠棉球肉芽肿增生方面,均以菝葜70%乙醇提取物的抗炎作用更为明显,这一结果可为后期继续研究不同极性有机溶剂对菝葜提取物的分离、纯化工艺提供药理学参考依据。同时,为适应中药现代化菝葜有效部位制剂的二次开发提供科学依据。

表2 菝葜不同溶剂提取物对大鼠棉球肉芽肿的影响Tab.2 Effect of different solvent extracts of Smilax China on cotton ball-induced granuloma in rats ±s

表2 菝葜不同溶剂提取物对大鼠棉球肉芽肿的影响Tab.2 Effect of different solvent extracts of Smilax China on cotton ball-induced granuloma in rats ±s

与模型对照组比较,*1P＜0.01,*2P＜0.05Compared with model control group,*1P＜0.01,*2P＜0.05

组别数量/只剂量/ (g·kg-1) 24 h干燥后肉芽肿净质量/[mg·(100 g)-1]肉芽肿抑制率/ %模型对照组11纯化水52.39±7.83*1…金刚藤胶囊组1116.233.85±4.21*135.50菝葜水提取物高剂量组1032.447.47±8.819.54中剂量组1016.250.27±8.434.01低剂量组108.152.27±7.190.19菝葜30%乙醇提取物高剂量组1032.443.52±8.50*216.98中剂量组1016.243.40±9.06*217.18低剂量组108.144.09±8.52*215.84菝葜50%乙醇提取物高剂量组1032.438.03±7.61*127.48中剂量组1016.238.45±8.31*126.53低剂量组108.139.08±6.77*125.38菝葜70%乙醇提取物高剂量组1032.434.46±6.23*134.16中剂量组1116.235.01±7.60*133.21低剂量组118.135.23±6.25*132.82菝葜95%乙醇提取物高剂量组832.441.94±11.47*120.04中剂量组1116.241.86±7.25*120.04低剂量组118.144.43±7.40*215.27

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DOI 10.3870/yydb.2014.07.005

Screening of the Different Concentrations of Ethanol Extracts fromSmilax China for Its Antiinflammatory Activity

LUO Yan-qin1,MA Yun1,SONG Lu-yao1,QIN Fei1,FAN Yin-zhou2,HOU Lian-bing1
(1.Department of Pharmacy,Nanfang Hospital,Southern Medical University,Guangzhou 510515,China;2.School of Pharmacy, Southern Medical University,Guangzhou 510515,China)

ObjectiveTo study the effects of the different concentrations of ethanol extracts ofSmilax Chinaon ear edema in mice and granuloma in rats,and to provide an evidence for optimizing the extraction process.MethodsEffects of different concentrations of ethanol extracts ofSmilax Chinaon the xylene-induced ear edema in mice and the cotton ball-induced granuloma hyperplasia in rats were tested.ResultsCompared with the model controls,70%ethanol extracts ofSmilax Chinaat high,mediumand lowdoses significantly inhibited ear edema in mice(t=2.58,P＜0.05;t=2.28,P＜0.05;t=2.17,P＜0.05) and reduced the granuloma hyperplasia in rats(t=5.28,P＜0.01;t=5.24,P＜0.01;t=5.17,P＜0.01).ConclusionThe 70%ethanol extracts ofSmilax Chinaat three doses present the most active antiinflammatory effect,confirmed in both mice ear edema and rats granuloma models.

Smilax China;Ethanol extracts;Edema,ear;Granuloma

R282.71;R285.5

A

1004-0781(2014)07-0858-05

2013-07-22

2013-08-25

*广东省医院药学研究基金(奥赛康基金) (2014A14)

罗艳琴(1988-),女,江西南昌人,在读硕士,主要研究方向:中药药理与药剂。E-mail:lyq20080831@163.com。

侯连兵(1957-),男,湖南株洲人,博士生导师,主任药师,主要研究方向:药物设计与药理学评价。电话:020-61642175,E-mail:hlianbing@163.com。