基于ITS2一级序列和二级结构对土茯苓及混伪品的鉴别研究△

郑梦迪，贺紫涵，张寒，张彦

西安医学院，陕西 西安 710021

土茯苓为百合科植物光叶菝葜Smilax glabraRoxb.的干燥根茎，味甘、淡，性平，具有除湿、解毒、通利关节的功能，在临床中有较高的药用价值[1]。现代药理研究表明，土茯苓具有免疫调节、抗肿瘤、缓解动脉粥样硬化、护肝、止咳祛痰、抗炎、镇痛等作用，为其药品、保健食品的开发提供了思路[2]。但作为一种常用中药，在采收、加工、使用过程中土茯苓不同品种混杂问题严重，且文献记载不严谨、外观表型相似和地方用药习惯等原因导致菝葜属、肖菝葜属及其他科属多种植物也被当做土茯苓使用[2-3]。这些混淆品大致分为两类，一类是以同属（菝葜属）植物黑果菝葜S.glaucochinaWarb.为主的“红土茯苓”，即地方俗称的“菝葜”；另一类是以百合科肖菝葜属植物肖菝葜Heterosmilax japonicaKunth 为主的“白土茯苓”，即俗称“土萆薢”。自古以来，四川和云南等地就有“土茯苓”“萆薢”“菝葜”混称和混用的习惯。目前，各地中药市场上土茯苓的混淆品较多，除主要混淆品菝葜、肖菝葜以外，还有菝葜属和肖菝葜属的多种植物，如马甲菝葜、长托菝葜、小果菝葜、合丝肖菝葜等也被当做土茯苓使用[4-5]。这种掺杂混淆品的现象，在一定程度上造成了土茯苓药材来源的品种混乱和质量良莠不齐，给土茯苓临床用药安全带来隐患。传统的中药材鉴别手段要求鉴定人员具有较高的植物分类专业知识和技能，这使中药材基原的准确鉴别具有一定局限性。因此，需要一种更科学、准确和稳定的方法作为补充鉴别方法。

本研究采用近年来迅速发展的DNA 条形码技术，可直接从基因水平上提供丰富的鉴别依据。此前，已有学者采用psbA-trnH序列对土茯苓的基原植物及其近缘种进行鉴定，然而出现了部分物种种内、种间无法识别的现象，matK、rbcL序列的变异位点也较少[6-7]。内转录间隔区2（internal transcribed spacer 2，ITS2）序列位于5.8 S和28 S rDNA 基因之间，具有长度短、易扩增的特点，适用于植物属、种的鉴定[8]，是目前植物分类研究和药用植物鉴定常用的分子标记之一[9-10]。在植物细胞中，ITS2 rDNA的二级结构是由一级序列自身回折而形成部分碱基配对和单链交替出现的茎环结构，真核生物ITS2 二级结构为高度保守的“一环四臂”模型[11]。ITS2 二级结构不仅包含系统发育信息，还可以补充和修正由于旁系同源或假基因所导致的系统发育树构建误差[12]。目前，关于土茯苓及其混伪品的鉴定研究尚无结合ITS2 核酸序列信息及其二级结构信息进行亲缘关系鉴定方面的研究[13]。因此，本研究建立更加成熟和标准的土茯苓DNA 条形码鉴定方法，为其DNA条形码的选择提供参考。

1 材料

本研究选取了土茯苓及常见混伪品的ITS2 序列作为实验研究对象，从GenBank 数据库下载土茯苓正品来源光叶菝葜S.glabraRoxb.序列5 条、混伪品菝葜属黑果菝葜S.glaucochinaWarb.序列4条、长托菝葜S.feroxWall.ex Kunth 序列3 条、马甲菝葜S.lanceifoliaRoxb.ex A.DC.序列3 条、小果菝葜S.davidianaA.DC.序列4 条和圆锥菝葜S.bracteataC.Presl 序列3 条；以及来自肖菝葜属的混淆品种肖菝葜H.chinensis（Kunth）A.DC.序列3 条、合丝肖菝葜H.japonicaKunth var.gaudichaudiana（Kunth）Wang et Tang 序列3 条和短柱肖菝葜H.yunnanensisGagnep.序列3 条。GenBank样本序列号及其对应物种信息见表1。

表1 GenBank土茯苓及其混伪品序列号及其对应物种信息

2 方法

2.1 ITS2序列的获取、注释及二级结构预测

在GenBank（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中选择Nucleotide 数据库，下载正品土茯苓及其混淆物种的ITS2 序列，再采用Blast 功能和序列注释信息剔除可疑序列。基于隐马尔可夫模型（HMM）[14]在ITS2 Database[15]中注释下载的每一条ITS 序列，去除两端5.8 S 和28 S 区域，得到经注释后完整的ITS2序列，再利用ITS2数据库对各样本进行ITS2二级结构的预测。

2.2 传距离及聚类分析

使用MEGA 7.0软件[16]统计30个样本ITS2序列的碱基含量，利用在线网站clustal omega（https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）对收集到的30 个样本进行同源对比，最终统计得出变异位点；基于Kimura-2-Parameter（K2P）模型进行遗传距离的计算，邻接法（neighbor-joining，NJ）构建系统发育树，设置bootstrap 分析1000 次重复以检测分支的可靠性。

2.3 ITS2一级序列联合二级结构构建系统发育树

通过ITS2 Database 下载各样本的一级和二级结构联合后的矩阵，将所有样本矩阵导入4Sale 1.7.1软件[17]进行比对。比对完成后构建ITS2 一级结构和二级结构系统发育树，比对好的结果导入ProfDistS软件[18]中，基于距离法构建剖面邻接（profile neighbor joining，PNJ）系统发育树，同样设置bootstrap 自展分析1000 次来检验系统发育树分支关系的可靠性。

3 结果

3.1 ITS2序列特征及差异性分析

对土茯苓及其混伪品进行ITS2 序列分析，如表2 所示，正品土茯苓光叶菝葜的序列长度平均值为245 bp，G+C 占比为82.70%；菝葜属混伪品黑果菝葜、长托菝葜、马甲菝葜、小果菝葜及圆锥菝葜ITS2平均序列长度为247、245、242、244、243 bp、G+C 占比为81.00%、78.40%、79.80%、81.00%、81.20%；肖菝葜属肖菝葜、合丝肖菝葜、短柱肖菝葜ITS2 平均序列长度分别为249、247、248 bp，G+C 占比分别为82.00%、81.60%、82.20%。土茯苓与各混伪品的变异位点数目和位置均存在差异（表3）。正品土茯苓（光叶菝葜）种内变异位点仅存在于222 位，共有2 种单倍型（A1 和A2），A1 包括4 条序列，碱基为A，占比80%；A2 包括1 条序列，碱基为C，占比20%。

表2 土茯苓及其混伪品序列特征

表3 土茯苓及其混伪品ITS2序列变异位点

3.2 遗传距离分析

基于K2P 模型在MEGA 7 中计算遗传距离。如表4 所示，土茯苓及各个混伪品的种内遗传距离均为0；而各种间遗传距离为0.008～0.059。其中，种间最小遗传距离为土茯苓和短柱肖菝葜0.008，种间最大遗传距离为长托菝葜和合丝肖菝葜0.059。土茯苓与其混伪品黑果菝葜的遗传距离为0.021，与土茯苓遗传距离最大的品种为长托菝葜0.044。

表4 土茯苓及其混伪品遗传距离

3.3 ITS2二级结构预测及分析

本实验利用ITS2 一级序列和二级序列联合矩阵，导入4Sale 1.7.1 软件中，得到土茯苓及其混伪品的二级结构。如图1 所示，二级结构为典型的“一环四臂”结构，臂Ⅲ为最长臂，其余臂长长度近似，但臂Ⅱ的结构最为保守，臂Ⅳ上有较大变异，中间的主环也较为保守，符合《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2020 年版规定的真核生物二级结构模型。对比各二级结构的臂Ⅰ，土茯苓有1个发夹环和1个内环，混伪品中的圆锥菝葜含2 个内环；在臂Ⅱ上，除短柱肖菝葜无嘧啶-嘧啶错配的内环外，土茯苓与其余混伪品均包含1 个内环。然而，在臂Ⅲ和臂Ⅳ中土茯苓与其他混伪品的区别最大。在臂Ⅲ上，从各内环的大小上看，马甲菝葜的嘧啶-嘧啶错配环明显大于土茯苓及其他混伪品；从内环数目上来看，短柱肖菝葜臂内环数最多有7个，圆锥菝葜和黑果菝葜的内环数较少，含4个内环；且圆锥菝葜和黑果菝葜的内环位置也与其他物种有明显差异。在臂Ⅳ中，长托菝葜较其他品种多一个内环；臂Ⅳ上突环的大小也有较大差异，如长托菝葜、肖菝葜、长托肖菝葜、合丝肖菝葜明显大于土茯苓及其他混伪品。综上所述，土茯苓与其最常见的混伪品黑果菝葜、肖菝葜在臂Ⅲ、臂Ⅳ有较明显的特征，如黑果菝葜臂Ⅲ较土茯苓和肖菝葜多1 个内环；肖菝葜在臂Ⅳ上的突出单链较土茯苓和黑果菝葜长。

图1 土茯苓及其混伪品的二级结构

3.4 NJ进化树和PNJ聚类树的系统发育分析

本研究利用ITS2 序列和一级序列及二级结构联合矩阵分析，分别构建了土茯苓与其混伪品的NJ系统发育树和PNJ系统发育树（图2）。在构建的NJ系统发育树中结果显示，土茯苓与黑果菝葜、肖菝葜及其他混伪品均分别聚类，不同物种各自聚为一支，且自展支持率均在60%以上的支系有9 个、80%以上的有6个、90%以上的有4个，说明不同混伪品与土茯苓的亲缘关系较远。另外，PNJ 系统发育树也表明了相同的分支情况，且分支更多，显示出更多的遗传信息，具有较好的单系性，在自展支持率上也有所提高。2 种系统发育树的结果均说明ITS2 序列适用于土茯苓及其混伪品或近缘种的鉴别。

图2 土茯苓及其混伪品的NJ系统发育树及PNJ系统发育树

4 讨论

ITS2 是《中国药典》2020 年版规定可用于植物物种鉴定的一种核心条形码，也是系统发育分析最常用的基因之一，ITS2 序列较短，相比ITS 有着更高的聚合酶链式反应（PCR）扩增成功率[19]。陈士林等[20]建议将ITS2序列作为药用植物的核心DNA条形码。《中国药典》2010、2015 年版已收录基于ITS2 序列鉴定药用植物的方法，并且在药用植物的分类鉴别中取得初步进展。然而，单独将ITS2 一级序列作为分子标记仍有一定局限性。首先，ITS2 不能满足所有科属植物的鉴别，如在杜鹃属中的鉴别效率仅为21.9%[21]；其次，ITS2 序列变异速度快，更适用于属以下级别物种的鉴别[22]。而ITS2 二级结构为不同物种的比对分类提供了一级序列未包含的更多信息。ITS2 二级结构有保守性结构“一环四臂”，因其“一环四臂”的结构有助于指导一级核酸序列的排列，对于一级核酸序列起到校正的作用[11-12]。

本研究通过对土茯苓及其混伪品ITS2 序列分析，搜集到的土茯苓ITS2 序列种内在222 bp 位点有1 个变异位点，保守性高、稳定性好；同时，遗传距离结果表明，土茯苓种内遗传距离为0，远小于土茯苓与其他混伪品的种间最小遗传距离0.008，符合“种间遗传距离符合10 倍以上”的种内遗传原则；联合一、二级结构共同构建的PNJ 系统发育树分析，得到与一级结构NJ系统发育树相对应的分支情况，同时使得系统发育树分支变多，提高了个别物种的自展支持率，PNJ 系统发育树对NJ 系统发育树起到了修正优化作用，即土茯苓可与其混伪品区分开；同时，正品土茯苓与混伪品的二级结构在各臂上环的数量、大小等存在较大的差异，二级结构的差异可以作为一种额外的信息指导土茯苓及其混伪品的鉴别。建议ITS2 可以作为鉴别土茯苓及其混伪品的DNA 条形码。本研究为药用正品土茯苓及其混伪品的准确鉴定提供了参考。