O-羧甲基壳聚糖复凝止血海绵的体外表征与止血作用*

刘辉,邹清河,吴迪,3

(1.广州军区武汉总医院药剂科,武汉 430070;2.湖北省宜都市第一医院药剂科,宜都 443300;3.湖北中医药大学药学院2010级研究生班,武汉 430065)

O-羧甲基壳聚糖复凝止血海绵的体外表征与止血作用*

刘辉1,邹清河2,吴迪1,3

(1.广州军区武汉总医院药剂科,武汉 430070;2.湖北省宜都市第一医院药剂科,宜都 443300;3.湖北中医药大学药学院2010级研究生班,武汉 430065)

目的 研究自制O-羧甲基壳聚糖复凝止血海绵的理化性质,并考察其止血效果。方法采用冷冻干燥技术制备O-羧甲基壳聚糖复凝止血海绵。通过观察外部形态,测定孔隙率、吸水率、密度等指标,表征止血海绵的理化性质;比较O-羧甲基壳聚糖止血海绵和市售吸收性明胶海绵对兔耳动、静脉创伤出血模型的止血效果。结果O-羧甲基壳聚糖复凝止血海绵呈类白色,疏松多孔,具有一定的韧性,网状结构均匀;孔隙率为67.23%,吸水率为38.77%,密度为0.043 4 g·(cm3)-1;该止血海绵的止血时间和出血量均低于市售吸收性明胶海绵,且无续发性再出血现象。结论该O-羧甲基壳聚糖复凝止血海绵理化性质稳定,止血效果可靠。

O-羧甲基壳聚糖;复凝止血海绵;体外表征;止血作用

壳聚糖具有显著的止血功效,无毒,生物相容性良好,可生物降解[1],在止血领域应用前景广阔。由于壳聚糖水溶性不佳,仅能溶于酸性溶液,极大地限制了其应用范围。笔者通过在壳聚糖C-6位上引入羧甲基功能基团,合成了具有特定取代度(44.53%)和脱乙酰度(0.64)的O-羧甲基壳聚糖(O-carboxymethyl chitosan,O-CMC)[2],不仅改善了壳聚糖在水中的溶解性能,而且还赋予其抗菌、抗氧化、止血愈创等多重功效[3-4]。笔者以凝血酶为复凝止血因子,以O-CMC为止血基材和凝血酶固定化载体,以戊二醛为交联剂,采用冷冻干燥技术优化并制得了具有凝血酶固定化作用的O-CMC复凝止血海绵。笔者在本实验中拟对这一新型止血剂的体外表征进行详细研究,并初步考察其止血效果,现报道如下。

1 材料与仪器

1.1 动物 日本大耳白兔5只,雄性2只,雌性3只,饲养环境及设施环境:普通级,体质量(2.6±0.2)kg,武汉市万千佳兴生物科技有限公司提供,合格证号: 4210000241,使用证号:00070998,许可证号:SYXK (鄂)2008-0007。

1.2 试药 O-CMC(自制,批号:20121124)、凝血酶(黑龙江迪龙制药有限公司,规格:每瓶500 U,批号: 20100601),25%戊二醛水溶液(上海化学试剂采购供应五联化工厂,批号:2010031S),甘露醇(青岛明月海藻集团有限公司,批号:20100221),10%水合氯醛(广州军区武汉总医院药剂科制剂室,批号:20110923),吸收性明胶海绵(金陵药业股份有限公司南京金陵制药厂,批号:110208),其余试剂均为分析纯。

1.3 仪器 EMS-8A电热式磁力搅拌器(天津市欧诺仪器仪表有限公司),LGJ-冷冻干燥机(军事医学科学院实验仪器厂),电子天平(Mettler-Toledo Group), Quanta 2000型环境扫描电镜(FEI公司)。

2 方法与结果

2.1 O-CMC复凝止血海绵的制备 称取O-CMC适量,溶于0.9%氯化钠溶液,配制浓度为2.49 mg·mL-1O-CMC溶液。将25%戊二醛用纯化水稀释,制得浓度为0.49 mg·mL-1的戊二醛溶液。将凝血酶溶于0.9%氯化钠溶液,制得浓度为49.87 U·mL-1凝血酶溶液。取O-CMC溶液10 g,置25 mL烧杯,缓慢滴加凝血酶溶液5 mL;搅拌10 min,另取戊二醛溶液0.1 mL和5%甘露醇1 mL,加入上述溶液中,搅拌均匀。将该混合液倒入直径6 cm培养皿,待完全胶凝后,置-20℃预冻24 h,再于-20℃真空冷冻干燥48 h,取出,即得O-CMC复凝止血海绵。

2.2 O-CMC复凝止血海绵的体外表征

2.2.1 O-CMC复凝止血海绵的外观形态 肉眼观察,自制止血海绵呈类白色,具有良好的韧性,疏松多孔,浸泡后膨胀且柔软;电镜下观察网状结构清晰,孔径均匀,疏密合适,见图1。

A.直观图;B.电镜图(×80)图1 O-CMC复凝止血海绵的外观形态A.direct-viewing figure;B.electron microscope figure(×80)Fig.1 Appearance and morphology of O-CMC multihemostatic sponge

2.2.2 O-CMC复凝止血海绵的孔隙率 选用10 mL量瓶,用乙醇定容,精密称质量,记为Wa;取自制止血海绵,精密称质量,记为W0,置于乙醇中脱气,使乙醇充盈于多孔海绵的孔隙中,然后加乙醇至刻度,精密称质量,记为Wb。将浸满乙醇溶液的止血海绵取出,准确称量剩余的乙醇与量瓶的总质量(Wc),按下式计算孔隙率:孔隙率(%)=(Wb-Wc-W0)/(Wa-Wc)× 100%,结果见表1。O-CMC复凝止血海绵的平均孔隙率为67.23%,这一较高孔隙率的止血海绵不仅可以提供足够的空隙和网状空间吸收更多的血液,而且能使海绵表面与创口有更大的接触表面,有利于止血基材O-CMC和复凝因子凝血酶起到更为迅捷的止血作用。

表1 O-CMC复凝止血海绵的孔隙率Tab.1 Porosity ratio of O-CMC multi-hemostatic sponge

2.2.3 O-CMC复凝止血海绵的吸水率 将冷冻干燥制得的O-CMC复凝止血海绵剪成圆形、长方形和不规则形等3种形状。分别精密称定质量,记为W1;然后将不同形状的止血海绵浸入纯化水中,浸泡24 h后,取出并精密称定质量,记为W2。自制止血海绵吸水率按如下公式计算:吸水率(%)=(W2-W1)/W1×100%,结果见表2。经测量计算,制得的O-CMC复凝止血海绵的平均吸水率为38.77%,不同形状止血海绵的吸水率差异无统计学意义(P＞0.05)。

2.2.4 O-CMC复凝止血海绵的密度 将干燥的OCMC复凝止血海绵裁剪成规则的矩形,精密称定质量,记为W;分别测量矩形的长、宽、高,计算其体积( V),即可根据公式求出止血海绵的密度(ρ),ρ=W/V,计算结果见表3,自制O-CMC复凝止血海绵的平均密度为0.043 4 g·(cm3)-1。

2.3 O-CMC复凝止血海绵的止血作用

2.3.1 止血效果验证 采用10%水合氯醛麻醉日本大耳兔(腹腔注射,1～1.5 mL·kg-1,受试例数:5),麻醉后耳部脱毛。用外科手术刀在耳部外侧中央处做一个创面2 cm×1 cm,其中耳动、静脉横向切断,但不使耳朵切透,以防止血液从兔耳部内侧流出而影响观察效果。待伤口流出的血液充满创面后,立即在兔耳出血处覆盖止血材料,外平铺加盖纱布,并用50 g砝码压迫,每30 s观察1次,直至出血停止。记录伤口出血到止血完成的时间,即为止血时间;止血后,将止血材料与纱布一起置入称量瓶密封,精密称重,计算该值与止血前各种止血材料和所用纱布的总质量的差值,即得出血量:出血量(g)=止血后材料质量-止血前材料质量。

表2 不同形状O-CMC复凝止血海绵的吸水率Tab.2 Water absorption ratio of O-CMC multihemostatic sponge with different shapes

表3 O-CMC复凝止血海绵的密度Tab.3 Density of O-CMC multi-hemostatic sponge

采用上述兔耳动、静脉创伤出血模型进行止血实验。结果显示,O-CMC复凝止血海绵的止血时间和出血量分别为(26.96±3.80)s和(0.045±0.020)g;市售吸收性明胶海绵(阳性对照)的止血时间和出血量分别为(100.4±11.2)s和(0.15±0.03)g;医用纱布(阴性对照)的止血时间和出血量分别为(218.2± 10.6)s和(2.57±0.54)g。O-CMC复凝止血海绵对创伤出血模型的止血时间和出血量显著低于阳性对照组(n=4,P＜0.01)和阴性对照组(P＜0.01),说明自制O-CMC复凝止血海绵的止血效果良好。

2.3.2 止血可靠性观察 待兔耳动、静脉创伤出血模型使用止血材料完全止血后,除去砝码,于30 min内继续观察其是否有续发性再出血现象(受试例数:5),结果O-CMC复凝止血海绵、市售吸收性明胶海绵和医用纱布的30 min内再出血例数分别为0,2,5例。

由结果可知,兔耳动、静脉创伤出血模型使用医用纱布止血后,均出现再出血现象,说明医用纱布只是压迫止血,不能使创面主动形成凝血块,当移走砝码后,伤口再度破裂,导致出血;市售吸收性明胶海绵对于出血量较多的兔耳动脉血管的止血效果不理想,尽管可以形成凝血块,但是由于动脉内血压较高,容易冲破已经形成的凝血块而发生再次出血现象。自制O-CMC复凝止血海绵对兔耳动、静脉血管均具有较好的止血作用,无续发性再出血现象,止血效果可靠。据此得出如下结论:对于静脉和较小的动脉出血,O-CMC复凝止血海绵和市售吸收性明胶海绵均有较好的止血效果,依次排序为:自制O-CMC复凝止血海绵≈市售吸收性明胶海绵＞医用纱布;而对于较大的动脉出血,自制O-CMC复凝止血海绵比市售吸收性明胶海绵的止血效果更佳。

3 讨论

采用冷冻干燥技术制得的O-CMC复凝止血海绵呈类白色,具有良好的韧性,疏松多孔,质地柔软,浸泡后均匀膨胀;孔隙率为67.23%,吸水率为38.77%,密度为0.043 4 g·(cm3)-1,理化性质稳定,符合海绵剂的要求。

以自制O-CMC复凝止血海绵与市售吸收性明胶海绵进行止血效果的研究,结果发现,自制止血海绵与市售吸收性明胶海绵相比,其止血时间更短,出血量更少,且无续发性再出血现象。

自制O-CMC复凝止血海绵理化性质稳定,止血效果理想,使用、携带方便,作为一种新型创伤止血制剂值得进一步深入研究。

[1] 郭仕华,贺艳丽.壳聚糖在医药领域中的应用[J].食品与药品,2005,7(8):1-4.

[2] 郭苗苗,徐丹,刘辉,等.水溶性O-羧甲基壳聚糖的制备及结构表征[J].中国药师,2012,15(3):296-300.

[3] 董鹏飞.羧甲基壳聚糖在医学领域中的应用进展[J].滨州医学院学报,2009,32(6):445-447.

[4] 吴迪,刘辉,浦金辉,等.O-羧甲基壳聚糖抑菌作用研究[J].医药导报,2013,32(2):142-145.

DOI 10.3870/yydb.2014.07.003

In vitro Characteristics and Hemostatic Effect of O-carboxymethyl Chitosan Multi-hemostatic Sponge

LIU Hui1,ZOU Qing-he2,WU Di1,3
(1.Department of Pharmacy,Wuhan General Hospital of Guangzhou Military Command,Wuhan 430070,China;2.Department of Pharmacy,the First Hospital of Yidu City,Yidu 443300,China;3.Postgraduate 2010,College of Pharmacy,Hubei University of Chinese Medicine,Wuhan 430065,China)

ObjectiveTo investigate the characteristicsin vitroand hemostatic function of O-carboxymethyl chitosan multi-hemostatic sponge.MethodsFreeze-drying technology was applied on preparation of O-carboxymethyl chitosan hemostatic sponge.The physicochemical properties of the self-produced multi-hemostatic sponge were observed for its appearance, porosity rate,water absorption,and density.The hemostatic effect was compared between the self-produced hemostatic sponge and commercially available absorbable gelatin sponge in rabbit models with ear venous and arterial injuries.ResultsThe selfproduced hemostatic sponge was off-white and full of pores with good tenacity and even net texture.Its porosity ratio,water absorption rate,and density were 67.23%,38.77%,and 0.043 4 g·(cm3)-1,respectively.The bleeding time volume were significantly lower fromthe self-produced sponge than that fromthe commercially available gelatin sponge.No secondary rebleeding was observed.ConclusionThe self-produced O-carboxymethyl chitosan multi-hemostatic sponge displays stable physicochemical characteristics and reliable hemostatic effect.

O-carboxymethyl chitosan;Multi-hemostatic sponge;Characteristicsin vitro;Hemostasis function

R286;R965

A

1004-0781(2014)07-0850-03

2013-07-17

2013-08-20

*武汉市科技攻关计划(200960323135);全军医学科研“十二五”计划课题(CWS11C27)

刘辉(1971-),男,湖北仙桃人,副主任药师,博士,研究方向:药物新剂型与新技术。电话:027-68879030,E-mail:pharmacyman@126.com。