理气消瘿片高效液相色谱指纹图谱研究*

胡俊杰,肖伊,王桂红,郑国华

(1.湖北中医药大学药学院,武汉 430065;2.湖北省孝感市食品药品监督管理局孝南区分局,孝感 432000)

理气消瘿片高效液相色谱指纹图谱研究*

胡俊杰1,肖伊2,王桂红1,郑国华1

(1.湖北中医药大学药学院,武汉 430065;2.湖北省孝感市食品药品监督管理局孝南区分局,孝感 432000)

目的 建立理气消瘿片的高效液相色谱(HPLC)指纹图谱,为其质量控制提供依据。方法色谱柱Aichrom Bond-AQ C18(250 mm×4.6 mm,5 μm),流动相乙腈-0.1%磷酸溶液(梯度洗脱),柱温30℃,流速1.0 mL·min-1,进样量20 μL,检测波长226 nm。结果建立了理气消瘿片的HPLC指纹图谱,共标定了13个共有峰,确认了其中4个共有峰,10批理气消瘿片指纹图谱的相似度均＞0.95。结论该方法准确、可靠,可以较全面、完整地反映理气消瘿片的质量。

理气消瘿片;图谱,指纹;色谱法,高效液相

理气消瘿片是根据湖北省中医院国家名老中医陈如泉教授的经验方研制而成的中药复方制剂,由青皮、白芥子、土贝母、柴胡等9味疏肝解郁、调理气机中药组成,具有疏肝理气、化痰消瘿之功效,主要用于痰气交阻型瘿病,临床疗效显著。该方中中药主要含有橙皮苷、芥子碱硫氰酸盐、土贝母苷甲、柴胡皂苷等[1-4]多种化学成分。目前,单对一种成分进行质量控制已经达不到有效控制和评价中药复方制剂的目的。指纹图谱能较全面地反映出组方中的成分[5],因此本实验应用高效液相色谱法(HPLC)对理气消瘿片进行指纹图谱的研究,建立理气消瘿片指纹图谱的共有模式,以实现多成分评价理气消瘿片及其成方制剂的质量的方法。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent1100型高效液相色谱仪(四元泵、紫外检测器及配套色谱工作站);Mettler-Toledo AG285型分析天平(Mettler-ToledoGmbH,Laboratory& Weighing Technologies,Switzerland);DZHW型调温电热套(北京市永光明医疗仪器厂);HH-4型数显恒温水浴锅(国华电器有限公司);KH-400-FDB型高功率数控超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)。

1.2 试药 橙皮苷对照品(批号:110712-200512)、柴胡皂苷a对照品(批号:110777-200404)、芥子碱硫氰酸盐对照品(批号:111702-200501)、土贝母苷甲对照品(批号:111536-200304)均购自中国食品药品检定研究院,乙腈、磷酸为分析纯,水为自制双蒸水,10批理气消瘿片由湖北中医药大学制剂实验室提供。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱Aichrom Bond-AQ C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相:乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B),按表1的条件进行梯度洗脱;柱温:30℃;流速:1.0 mL·min-1;进样量:20 μL;检测波长: 226 nm[6-7]。

2.2 供试品溶液的制备 取理气消瘿片10片,除去包衣,研细,取0.5 g,精密称定,置圆底烧瓶中,加60%甲醇40 mL,回流提取60 min,滤过,定容于50 mL量瓶中,摇匀,滤过,取续滤液,即得。

表1 流动相梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution program of mobile phase

2.3 对照品溶液的制备 分别取橙皮苷、芥子碱硫氰酸盐、土贝母苷甲、柴胡皂苷a对照品适量,置10 mL量瓶中,加入适量甲醇,超声溶解,定容,摇匀,滤过,即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度实验 取理气消瘿片粉末0.5 g,精密称定,按“2.2”项下方法制备供试品溶液,按“2.1”项下色谱条件连续重复进样6次,记录指纹图谱并分析。结果,各共有峰相对保留时间的RSD为0.06%～0.67%,相对峰面积的RSD为0.25%～1.84%,RSD均＜3%。表明本方法精密度良好。

2.4.2 重复性实验 取理气消瘿片粉末0.5 g,精密称定,共6份,分别按“2.2”项下方法制备供试品溶液,按“2.1”项下色谱条件进样,记录指纹图谱并分析。结果,供试品中各共有峰相对保留时间的RSD为0.14%～0.83%,相对峰面积的RSD为0.65%～1.64%,RSD均＜3%。表明本方法重复性良好。

2.4.3 稳定性实验 取理气消瘿片粉末0.5 g,精密称定,按“2.2”项下方法制备供试品溶液,分别于0,2, 4,8,24 h按“2.1”项下色谱条件进样,记录指纹图谱并分析。结果,供试品中各共有峰相对保留时间的RSD为0.12%～0.73%,相对峰面积的RSD为0.33%～2.55%,RSD均＜3%。表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.5 理气消瘿片指纹图谱的建立及其技术参数

2.5.1 理气消瘿片HPLC指纹图谱建立 取理气消瘿片粉末,分别按“2.2”项方法制备供试品溶液,按“2.1”项色谱条件进样,记录指纹图谱并分析,获得理气消瘿片的HPLC指纹图谱。见图1。

2.5.2 共有指纹峰的标定 采用国家药典委员会颁布的中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(版本: 2004 A)进行分析[8],根据相关要求[9],确定共有峰和指纹峰。以相对保留时间标定其共有峰13个,以第4号峰为参照峰S,测定各共有峰相对保留时间,结果表明RSD＜3.0%。见表2。

2.5.3 共有峰的归属 分别吸取芥子碱硫氰酸盐、橙皮苷、土贝母苷甲、柴胡皂苷a对照品溶液,进样20 μL,按“2.1”项下色谱条件进样测定,对比其保留时间和相应时间位置的色谱峰,确定指纹图谱中的4号峰为芥子碱硫氰酸盐,7号峰为橙皮苷,10号峰为土贝母苷甲,12号峰为柴胡皂苷a。

图1 理气消瘿片的HPLC图Fig.1 HPLC chromatogram of liqi xiaoying tablets

2.5.4 相似度计算 采用国家药典委员会颁布的中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(版本:2004 A)[8]对10批样品进行相似度分析。以S为参照得出对照指纹图谱,以此为基础进行整体相似度评价。结果10批样品相似度依次为0.957,0.981,0.958, 0.969,0.980,0.953,0.982,0.956,0.956,0.953,均＞0.95,表明10批样品中的化学成分较一致。

表2 10批样品共有峰的相对保留时间Tab.2 Relative retention time of common peaks from ten batches of samples min

3 讨论

3.1 流动相的选择 本实验考察了甲醇-水,甲醇-不同浓度的磷酸水,乙腈-水,乙腈-不同浓度的磷酸溶液洗脱系统,其中乙腈-0.1%磷酸水系统出峰数目较多,峰形和分离也比较理想。在此基础上,调整乙腈与0.1%磷酸梯度洗脱比例关系,最终确定本实验的色谱洗脱条件。

3.2 检测波长的选择 取一定浓度的供试品溶液,在波长200～700 nm范围内进行全波长扫描,同时分别比较样品在检测波长226,254,280,365 nm处指纹图谱的峰数目多少与分离度情况。结果表明在检测波长226 nm时,色谱峰较多,分离度好,且部分药材中已知主要化学成分都有显示,故选择检测波长226 nm。

中药是一个由多组分、多因素构成的复杂体系,其化学成分的多样性与复杂性是其疗效的物质基础[10]。本研究建立了理气消瘿片HPLC指纹图谱,所得到的色谱图相似度＞0.95,符合要求;标定了共有特征(指纹)峰13个,并通过对照实验,确定指纹图谱中的4号峰为芥子碱硫氰酸盐,7号峰为橙皮苷,10号峰为土贝母苷甲,12号峰为柴胡皂苷a。本研究中所建立的方法有较好的重复性、精密度和稳定性,可以完整、全面地反映理气消瘿片的质量,为理气消瘿片的质量控制提供科学依据。

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DOI 10.3870/yydb.2014.08.024

High Performance Liquid Chromatograph Fingerprint of Liqi Xiaoying Tablets

HU Jun-jie1,XIAO Yi2,WANG Gui-hong1,ZHENG Guo-hua1
(1.College of Pharmacy,Hubei College of Chinese Medicine,Wuhan 430065,China;2.XiaonanDistrict Bureauof XiaoganFoodandDrug Administration,Xiaogan 432000,China)

Objective To establish high performance liquid chromatograph(HPLC)fingerprint ofliqi xiaoyingtablets,and to provide reference for quality control of the herbal medication.MethodsThe chromatography conditions consisted of Aichrom Bond-AQ C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)column with mobile phase of acetonitrile-0.1%phosphoric acid (gradient elution),column temperature of 30℃,flow rate of 1 mL·min-1,injection volume of 20 μL,and UV detection wavelength of 226 nm.ResultsHPLC fingerprint was established with 13 common peaks,4 of which were identified.The similarity of the HPLC fingerprints ofliqi xiaoyingtablets from 10 batches was greater than 0.95.ConclusionThe method is accurate,reliable,and can reflect complete information for the quality ofliqi xiaoyingtablets.

Liqi xiaoyingtablets;Chromatography,fingerprint;Chromatograph,high performance liquid

R286;R927.2

A

1004-0781(2014)08-1067-04

2013-10-07

2014-01-06

*武汉市科技攻关计划(200860423218)

胡俊杰(1984-),男,湖北孝感人,实验员,硕士,从事中药新制剂、新剂型的研究。电话:(0)13407126284, E-mail:Hero0712@163.com。

郑国华(1964-),男,天津人,教授,博士,从事中药新制剂、新剂型的研究。电话:(0)13627108243,E-mail: zgh1227@sina.com。