Caspase-1抑制剂对大鼠血管平滑肌细胞钙化的初步影响

彭利静，拓步雄，李超民

解放军第451医院 心血管内科，陕西 西安 710054

动脉钙化主要指钙以磷酸盐形式沉积在动脉壁组织的一种病理改变。传统观点认为血管钙化是钙盐在细胞内及细胞外基质的被动沉积，但最近的研究发现，血管钙化形成的早期类似骨细胞形成，这个过程是主动、可预防、可逆转和高度可调控的生物学过程，因此动脉钙化发生早期的中心环节是血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMC）、血管周边细胞等向成骨样细胞的转分化[1]。

骨保护素（osteoprotegerin，OPG）及核因子κB受体活化因子配体（receptor activator of nuclear fac⁃tor κB ligand，RANKL）是最近发现的调节动脉钙化发生的重要因子，而且有大量的细胞因子能够调节OPG/RANKL的水平，但在动脉钙化发生中OPG/RANKL上游信号目前尚不清楚[2]。我们前期的工作发现钙化发生过程中Nalp3炎症小体复合体的激活，提示Nalp3炎症小体复合体可能作为其上游信号，通过改变OPG/RANKL水平来调节钙化发生。在此，我们通过caspase-1抑制剂zVAD来抑制Nalp3炎症小体的激活，并检测OPG/RANKL的表达水平及其对血管平滑肌细胞钙化的影响。

1 材料和方法

1.1 材料

SD大鼠，体质量约150 g，购自军事医学科学院实验动物中心；DMEM培养基购自Gibco公司；小牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；茜素红、β-磷酸甘油酯（β-GP）购自北京欣经科生物技术有限公司；zVAD、反转录试剂盒购自Promega公司；TRIzol购自天根公司；引物由北京奥科公司合成。

1.2 血管平滑肌细胞原代分离与培养[3]

取SD大鼠，无菌操作取出主动脉，放入DHank's液中反复冲洗，去除残留血液，用小镊子剥去外膜，用解剖剪纵行剪开血管，在培养皿中用消毒的棉签小心擦去内膜，用解剖剪将血管剪碎，大小为1 mm见方，将组织块放入培养瓶中铺开，间距以0.5 cm为宜，将培养瓶翻转过来放入培养箱中静置4～5 h，取出培养瓶并小心加入培养基至刚好覆盖组织块，放入培养箱中培养1周，1周后观察细胞生长情况，待长至铺满80%时用0.25%的胰酶消化传代，待传入培养皿中静置时吸取上清液离心重悬接种于另一培养皿中，如此反复多次用差速贴壁法纯化细胞直至5～7代。

1.3 钙化模型建立[2]

将原代培养的5～7代细胞传代培养，首先用含10%血清的正常DMEM培养基培养，待细胞长至60%左右时，加入含10 mmoL/L β-GP的DMEM培养基诱导钙化，对照组则继续用正常培养基培养，每2 d换一次培养基，连续培养10 d。

1.4 钙化模型染色鉴定[2]

钙化细胞弃去培养基，用1×PBS洗3次，六孔板中加入500 μL/孔4%多聚甲醛，37℃固定25 min，然后用去离子水洗3次，加入500 μL 1%茜素红，室温温育25 min，吸去染液，用去离子水洗4次，在通风橱中干燥2～3 min，吹干去离子水，于倒置显微镜下观察鉴定并拍照记录。

1.5 RNA提取及半定量PCR

收取钙化不同时间点（0、2、4、6、8、10 d）的细胞，加入1 mL TRIzol裂解，用氯仿抽提RNA，异丙醇沉淀RNA，并用75%的乙醇洗涤RNA沉淀物2次，用100 μL DEPC水溶解RNA；取2 μg RNA用反转录试剂盒反转录，取2 μL反转录产物作为模板进行PCR扩增基因，扩增条件为95℃预变性5 min、95℃变性 45 s、58℃退火 30 s、72℃延伸 1 min。Rat OPG上游引物为5'-AGTTTATTTAACAGACTGCCA CCAG-3'，下游引物为5'-GTAATAAGAGGGCGCA TAGTCAGTA-3'；Rat RANKL上游引物为5'-CGCT CTGTTCCTGTACTTTCGAGCG-3'，下游引物为5'-TCGTGCTCCCTCCTTTCATCAGGTT-3'；Rat β-actin上游引物为5'-CACCCGCGAGTACAACCTTC-3'，下游引物为5'-CCCATACCCACCATCACACC-3'。

2 结果

2.1 caspase-1抑制剂zVAD可以下调OPG/RANKL的表达

将VSMC分为2组，一组添加zVAD，另一组不加zVAD，只加入zVAD的溶剂DMSO，2组用β-GP分别诱导 0、2、4、6、8、10 d，收取细胞裂解液提取总RNA，对OPG、RANKL进行半定量PCR检测，并通过凝胶电泳检测OPG及RANKL的表达，结果见图1，单加入β-GP后OPG和RANKL等基因的转录水平在钙化第2 d开始上升，但加入caspase-1抑制剂zVAD后OPG、RANKL转录水平降低，表明抑制炎症小体中caspase-1的活性，能够抑制OPG和RANKL的转录水平。

2.2 caspase-1抑制剂zVAD抑制动脉钙化的程度

从图1可以看到caspase-1抑制剂zVAD可下调OPG/RANKL的表达，接下来我们通过茜素红钙化染色研究caspase-1抑制剂zVAD对动脉钙化的影响，茜素红钙化染色呈红色的细胞说明发生了钙化。结果见图2，细胞用zVAD处理后，钙化程度相对于未加入zVAD组明显改善。

3 讨论

图1 caspase-1抑制剂zVAD可以下调OPG/RANKL的表达

OPG是一种分泌糖蛋白，是肿瘤坏死因子（TNF）受体超家族成员，在骨的稳态平衡中起重要的调节作用，最近发现OPG与血管钙化密切相关。OPG主要在平滑肌细胞和内皮组织细胞中表达，是RANKL和TRATL的受体，OPG与RANKL和TRATL结合[4]，抑制了RANKL和TRATL与其同族受体的结合，从而抑制了特异性前炎症和前凋亡信号通路的活性。OPG参与血管细胞因子之间的网络联系[5]，前炎症细胞因子如TNF-α及血小板衍化生长因子[6]在内皮细胞和血管平滑肌细胞中能诱导OPG表达，从而使OPG参与各种炎症信号通路。

图2 caspase-1抑制剂zVAD抑制动脉钙化的程度

我们的研究发现，OPG在β-GP诱导的VSMC钙化发生过程中表达上升，RANKL也有类似结果。对于OPG在钙化发生期间持续表达，许多学者认为是一个血管代偿性的防御机制，在动脉粥样硬化或血管疾病高危情况下，为了使过度激活的炎症通路和其他有害刺激降到正常水平而使OPG上调[7-8]。茜素红染色显示β-GP刺激VSMC后2 d开始出现明显的钙盐沉积，而Nalp3炎症小体在早期（加入β-GP 0.5 d，结果未示）就开始被激活；另外，在我们加入炎症小体抑制剂zVAD后，OPG/RANKL的表达量增加过程减缓且钙化程度减弱，这表明炎症小体反应是OPG/RANKL的上游事件。这个过程中是否还存在其他的调节因子并不清楚，有待进一步研究。

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