极端嗜热厌氧菌Caldicellulosiruptor木质纤维素降解研究

孟冬冬，张坤迪，英 瑜，陈晓华，李福利

(1.中国科学院 青岛生物能源与过程研究所，青岛 266101;2.中国科学院大学，北京 100049;3.中国水产科学研究院 黄海水产研究所，青岛 266071)

化石能源是一种不可再生资源，随着社会经济的发展，日益增大的能源需求及能源储量的减少逐渐成为制约人类发展的一大瓶颈。木质纤维素作为地球上广泛存在的可再生资源，将其转化成可发酵的单糖或寡糖，是解决能源危机的有效途径。在这一转化过程中，纤维素酶是决定其能否高效进行的关键。因此，寻找具有高效木质纤维素降解能力的菌株并对其进行深入研究成为人们关注的焦点。

Caldicellulosiruptor属菌株属于极端嗜热厌氧菌，具有极强的木质纤维素降解能力。从20世纪80年代第一个Caldicellulosiruptor属菌株C.saccharolyticus DSM 8903分离以来［1］，人们又陆续分离得到了7个同属的菌株，并分别研究了它们的生理生化性质及木质纤维素降解能力。伴随着8株菌的基因组测序完成，人们在其遗传转化体系及相关纤维素酶的研究方面也取得了一系列研究进展。本文中笔者将对Caldicellulosiruptor属菌株的研究现状及前景进行综述和展望。

1 极端嗜热纤维素降解厌氧菌的多样性

微生物根据其最适生长温度可以分为嗜热微生物(50～70℃)和极端嗜热微生物(＞70℃)，而最适生长温度大于80℃的极端嗜热微生物又称为超嗜热微生物［2］。在高温环境下，由于O2溶解度低及存在一些还原性气体，这种生态环境下的微生物多为厌氧或微好氧微生物。极端嗜热微生物分布广泛，包括温泉、火山口、浅海海滩、深海地热口以及生物堆肥等生态环境［3］。目前，在多个属中发现有极端嗜热纤维素降解厌氧菌，包括Thermotoga、Caldicellulosiruptor、Thermoanaerobacter、Thermoanaerobacterium和Clostridium属等。

与常温微生物一样，嗜热厌氧菌也需要通过一系列的机制获得营养和能源。嗜热厌氧菌利用其丰富的糖苷水解酶(GHs)及转移酶(GTs)将自然界中各种简单或复杂的碳水化合物转化成自身的C源和能源，同时也为我们提供了丰富的嗜热纤维素酶库。与常温纤维素酶相比，这些来源于嗜热厌氧菌的纤维素酶具有热稳定性好、半衰期长等优点，因此可以提高酶的使用效率，在生产中降低酶的用量，减少生产成本。

2 Caldicellulosiruptor属菌株降解未预处理木质纤维素的研究进展

Caldicellulosiruptor属目前包含8个种，属于革兰氏阳性菌，GC含量较低，而且不产生孢子。它们的最适生长温度在65～78℃，可以高效降解多种复杂碳水化合物。与多个Clostridium菌株不同的是，Caldicellulosiruptor菌株不产生纤维小体，而是将游离的纤维素酶分泌到周围环境中。Caldicellulosiruptor菌株可以同时发酵C5和C6的单糖，是整合生物加工工艺(CBP)的优先候选者。

2.1 Caldicellulosiruptor属菌株具有广泛的底物利用谱

C.saccharolyticus是从新西兰淡水温泉中分离得到的嗜热厌氧菌，能够利用纤维素、半纤维素以及果胶等生物质，是Caldicellulosiruptor属分离得到的第一个模式菌株［1］。C.saccharolyticus可以同时发酵C5和C6单糖，并有极高的产氢得率(1 mol葡萄糖产生4 mol H2)［4］。C.bescii初始称为 Anaerocellum thermophilum，是Caldicellulosiruptor属中研究较多的嗜热厌氧菌［5］，可以利用未经过预处理的木质纤维素作为C源［6］。Caldicellulosiruptor属菌株能代谢多种单糖和寡糖，可以同时利用葡聚糖和木聚糖作为C源，降解预处理或未预处理的木质纤维素［4－5，7－15］(表 1)。

2.2 Caldicellulosiruptor属菌株具有极强的降解未预处理木质纤维素能力

木质纤维素的主要组成是纤维素、半纤维素和木质素［16］。纤维素是植物细胞壁中含量最丰富的组成成分，是由D-葡萄糖以β-1，4-糖苷键连接而成的同多糖，其聚合度在10 000或者更高。纤维素链间残基通过氢键和范德华力维系。若干条链聚集成紧密的有周期性晶格的分子束，称微晶或胶束。多个这样的胶束平行排列组成线状的微纤维。

半纤维素是由几种不同类型的单糖(包括五碳糖和六碳糖)构成的异质多聚体，其包括的单糖类型有:D-葡萄糖、D-半乳糖、D-木糖、D-甘露糖、L-阿拉伯糖、D-葡萄糖醛酸和4-O-甲基-D-葡萄糖醛酸。半纤维素多糖大多具有侧链，聚合度小于200，侧链常被乙酰化。在植物细胞壁中，半纤维素常与微纤维非共价结合成为基质多糖。

木质素是一种复杂的不溶性酚类聚合物，主要存在于植物的次生壁中，通过与多糖组分 (尤其是半纤维素)共价结合形成交织网来硬化细胞壁，起抗压作用，具有较强的抗化学成分、真菌和细菌攻击能力。

木质纤维素的降解需要大量酶的协同作用才能完成［17］。3 类主要的纤维素酶:内切-β-1，4-葡聚糖酶(endo-β-1，4-glucanase，EG，EC 3.2.1.4)、纤维二糖水解酶(cellobiohydrolase，CBH，EC 3.2.1.91)和β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，BG，EC 3.2.1.21)共同作用，将β-1，4-糖苷键连接的纤维素葡聚糖链降解为单糖(图1)。半纤维素的复杂性及异质性决定了其完全降解过程要求更多的半纤维素酶参与其中。最常见的几种半纤维素酶有木聚糖酶(xylanase)、β-甘露聚糖酶(β-mannanases)、α-L-阿 拉 伯 呋 喃 糖 苷 酶 (α-L-arabinofuranosidases)、α-D-葡糖醛酸糖苷酶(α-D-glucuronidase)、β-木糖苷酶(β-xylosidases)及半纤维素酯酶(hemicellulolytic esterases)(图2)。

未预处理的木质纤维素是指经过粉碎、洗涤、烘干等步骤除去物质表面的可溶性成分，从而制成的颗粒大小相对均匀的天然木质纤维素材料，这一过程未经过其他物理、化学处理，不涉及木质纤维素化学键的断裂及结晶结构的破坏。Yang等［6］研究发现:C.bescii可以有效降解未预处理的木质纤维素。不溶性木质纤维素底物(如柳枝稷和白杨木)粉碎后，在菌株最适生长温度(75℃)下，悬浮在蒸馏水(0.02 g/mL)中搅拌过夜，之后经75℃蒸馏水洗涤2次，经滤膜筛选得到40～60 μm粒径的颗粒，经50℃烘干后，制成未预处理的木质纤维素。C.bescii利用未预处理的柳枝稷和白杨木作为C源，10 h即可进入稳定期，细胞数目达到1×108个/mL。收集培养菌体后，培养基中残余的木质纤维素经上述洗涤烘干处理，制备不溶性底物。研究结果显示，使用过1次和2次的不溶性木质纤维素均可以作为C源支撑C.bescii的生长，菌株在15～20 h可以达到稳定期。对用过的不溶性木质纤维素分析显示，作为其组成成分的纤维素、半纤维素和木质素的比例没有发生变化。菌株培养10 d时，未预处理的柳枝稷和白杨木利用率分别为26%和15%。上述实验结果反映了该菌株具有独特高效的降解未经预处理木质纤维素的能力。

图1 纤维素酶及纤维素降解［17］Fig.1 Cellulase and cellulose hydrolysis［17］

图2 半纤维素酶及半纤维素降解［17］Fig.2 Hemicellulase and hemicellulose hydrolysis［17］

笔者所在课题组筛选到的嗜热厌氧菌Caldicellulosiruptor sp.F32，是与模式菌株Caldicellulosiruptor saccharolyticus DSM 8903同种的菌株，二者比较，F32表现出更强的木质纤维素降解能力。小麦秸秆经过上述处理步骤制成未预处理的木质纤维素，以其作为C源添加到培养基中，培养至稳定期，F32细胞数目是模式菌株细胞数目的3倍。进一步分析F32和DSM 8903胞外酶活，结果显示F32具有较高的内切纤维素酶活性与木聚糖酶活性。2株菌胞外纤维素酶活性差异造成了它们木质纤维素降解能力的强弱。

木质纤维素是一种交联致密的杂合物，具有较高的结晶度以及低的可及度，微生物或纤维素酶较难将其降解。微生物降解纤维素的速率随着温度提高急剧增大，因此，相较于嗜常温微生物，嗜热厌氧菌在生物质转化方面具有巨大优势。Caldicellulosiruptor属的菌株能分泌大量游离的嗜热纤维素酶，在其最适生长温度的高温条件下，具有极高的木质纤维素降解速率。另外，65～78℃的高温环境更有利于纤维素酶与木质纤维素的吸附以及酶对底物晶体结构的破坏。高温环境和丰富的、高催化效率的纤维素酶造成了Caldicellulosiruptor属的菌株具有极强的针对未预处理木质纤维素的降解能力。

2.3 Caldicellulosiruptor属基因组、转录组及蛋白质组研究进展

Caldicellulosiruptor属8个种模式菌株的全基因组测序已经完成，这些信息的获得极大推动了嗜热厌氧菌在木质纤维素降解方面的研究。8个菌株基因组大小为2.43～2.97 Mb，基因组平均大小为2.74 Mb，平均GC含量为35.5%(表1)。Caldicellulosiruptor属是一个巨大的纤维素酶库，每个种的菌株都包含了37～62个糖苷水解酶(glycoside hydrolase，GH)、1 ～4 个多糖裂解酶(polysaccharide lyase，PL)、4 ～9 个碳水化合物酯酶(carbohydrate esterase，CE)以及27～35个糖基转移酶(glycosyl transferase，GT)，另 外 还 有 12～39个 ABC transporters(表2)。全属的菌株共有4 009个ORFs编码分布于43个家族的106个糖苷水解酶［18］。

Caldicellulosiruptor属菌株的转录组测序工作也已经取得了一些研究进展。C.bescii基因组中的2 776个蛋白编码序列，其中有171个和88个基因与碳水化合物的转运和利用相关。纤维素对单糖的转录组分析显示，有32个碳水化合物活性基因、61个糖转移基因和25个转录因子得到上调［7］。Vanfossen等［19］对 C.saccharolyticus的代谢进行了转录组分析。葡萄糖对半乳糖的转录组分析显示有32个开放阅读框(ORFs)明显上调，而葡萄糖对甘露糖则有353个ORFs明显上调。该研究也探讨了C.saccharolyticus的C源代谢抑制(carbon catabolite repression，CCR)作用机制。通过转录组及比较基因组学研究，C.saccharolyticus至少含有24个碳水化合物特异的ABC transporters以及1个磷酸转移酶系统(phosphotransferase system，PTS)。对多种单糖(阿拉伯糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖和木糖)的转录组分析显示，大多数ABC transporter仅在一种单糖或多糖作为C源时会上调，而基因Csac_0692和Csac_0694在6种单糖的混合液中才会上调，这2个基因注释为结合蛋白(binding protein)。基因组及转录组分析显示，大量的碳水化合物利用及转运蛋白共同作用，从而使得菌株具有极广的底物利用谱。

表2 Caldicellulosiruptor属菌株碳水化合物相关模块及转运体系［18］Table 2 Carbohydrate-related domains and transporter inventory of the genus Caldicellulosiruptor［18］

C.bescii和C.obsidiansis的分泌蛋白中都包含 了大约400个蛋白，其中大部分为多结构域的糖苷酶、胞外结合蛋白及功能未知的蛋白。质谱结合纤维素酶活性测定分析表明，胞外蛋白中多结构域的糖苷酶，如 GH5、9、10、44、48 以及 CBM3 模块具有很高的丰度［20］。分别以纤维二糖、结晶纤维素、柳枝稷作为C源培养C.obsidiansis，分析其胞外蛋白组成变化。与以结晶纤维素作为底物相比，以纤维二糖为C源培养菌体时，可以诱导产生大量胞外的多功能糖苷酶;而以不溶性底物作为C源时，与运动和底物吸附相关的鞭毛、纤毛、趋药性蛋白含量增大［21］。Caldicellulosiruptor sp.F32可以同时代谢五碳糖和六碳糖，且具有高效降解纤维素的特点。在双向凝胶电泳(two-dimensional gel electrophoresis，2DE)和质谱技术的支持下，分析了Caldicellulosiruptor sp.F32在微晶纤维素和葡萄糖为C源的培养基中胞外蛋白的差异［22］。对微晶纤维素培养后大量表达的23个蛋白进行质谱鉴定分析，发现这些蛋白包括纤维素酶、木聚糖酶、普鲁兰酶、胞外结合蛋白、S-layer蛋白、ABC transporter蛋白及未知功能的蛋白。

2.4 遗传转化平台的建立

遗传转化体系的建立是进行菌株改造、机制研究的基础，但由于Caldicellulosiruptor属细菌体内存在着许多限制修饰系统(restriction-modification system，RM system)，通过简单的DNA序列分析很难准确获得这些限制修饰酶的功能，这对遗传转化体系的建立造成很大的困难。另外，Caldicellulosiruptor是嗜热厌氧菌，属于革兰氏阳性菌，具有较厚的细胞壁，外源遗传物质很难通过物理、化学方法进入细胞内部，这进一步加大了遗传转化平台建立的难度。

Chung等［23］对 C.bescii DSM 6725 的研究取得了突破。菌株C.bescii中一个新的热稳定的限制酶CbeI(Athe_2438)首先被克隆表达并得到深入研究，通过对其酶切位点分析表明，CbeI与限制酶HaeIII是同尾酶(isoschizomer)［23］。进一步分析 C.bescii基因组信息及甲基化实验验证，得到了与限制酶CbeI对应的DNA甲基化酶M.CbeI(Athe_2437)。在构建尿嘧啶营养缺陷型C.bescii菌株的基础上，通过电转化的方法实现了菌株的遗传转化［24］。以上述研究为基础，C.bescii菌株中的限制酶cbeI基因(Athe_2438)被成功敲除，从而实现了将来源于菌株C.hydrothermalis的质粒DNA转化进入C.bescii菌株［25］。

2.5 嗜热纤维素酶的研究进展

Caldicellulosiruptor属菌株具有极强的纤维素和半纤维素降解能力，是一个巨大的嗜热纤维素酶资源库(表2)。其糖苷水解酶模块分布于43个家族，种类非常丰富。Caldicellulosiruptor属的糖苷水解酶大多是具有多结构域的蛋白，它们通常是由1个或2个催化结构域(GH)结合1个或多个碳水化合物结合结构域(CBMs)构成的，这些与碳水化合物降解相关的基因，很多在染色体上是成簇存在的。C.saccharolyticus基因组中有2个GH簇在纤维素及半纤维素降解中有着重要作用。基因簇Csac_1076到Csac_1081编码的CelA-ManA作为纤维素酶起作用;另外一个大的基因簇XynB-XynF(Csac_2404-Csac_2411)编码胞外或胞内蛋白，作用于木聚糖及其侧链基团以及 CMC［26］。在 Caldicellulosiruptor属的8个菌株里面，有一些纤维素酶的ORFs是共有的，属于17个家族的26个糖苷水解酶(GHs)组成了核心纤维素酶［18］。

C.saccharolyticus中的CelB(Csac_1078)是一个双功能蛋白，GH5与GH10模块通过CBM3连接。GH5模块具有纤维二糖水解酶活性，可以有效地酶解纤维素［27］;GH10具有 CMC 和木聚糖酶活性［26］。C.saccharolyticus中的CelA(Csac_1076)是一个模块化的酶，GH9与GH48催化结构域通过3个CBM连接，C.bescii菌株中也存在与其同源性非常高的纤维素酶CbCelA。通过克隆构建一系列CbCelA截短蛋白，表明CbCel9A为持续性内切纤维素酶，对不溶性纤维素具有较高活力;CbCbh48A为纤维二糖水解酶;而CBM与热稳定性、渐进性、底物吸附有关［28］。Cel9B/Man5A［29］和 CbMan5B/Cel44A［30］是C.bescii菌株中的另外2个双功能纤维素酶，其不同结构域功能都得到了实验验证。Caldicellulosiruptor属菌株基因组中有许多 S-layer蛋白，在Caldicellulosiruptor sp.F32的胞外蛋白中也大量存在［22］。C.saccharolyticus中的 S-layer蛋白 Csac_0678功能得到了验证，其催化结构域GH5具有内切葡聚糖酶和木聚糖酶活性，而S-layer结构域对GH5 催化功能没有影响［31］。

木聚糖酶是木质纤维素降解的另一个关键酶。Caldicellulosiruptor sp.F32具有极强的降解未预处理的小麦秸秆的能力。通过基因组分析，F32具有2个木聚糖酶，分别属于GH10和GH11家族，系统进化树如图3所示。F32中2个热稳定的极端嗜热木聚糖酶最适温度在75℃，但二者具有不同的特性，Ying等［32］研究发现木聚糖酶JX030400比酶活是木聚糖酶JX030401的9倍。另外，通过异源表达发现，F32中有许多嗜热纤维素酶(表3)。如，地衣聚糖酶(KC958563)是一个新的具有专一 β-1，3-1，4-葡聚糖键水解特异性的耐热酶［33］。

图3 木聚糖酶JX030400和JX030401系统进化树［32］Fig.3 Phylogenetic tree of JX030400，JX030401 and their closely related gene sequences

表3 来源于F32的嗜热纤维素酶及半纤维素酶Table 3 Thermostable lignocellulase in strain F32

嗜热纤维素酶具有热稳定性好、半衰期长等优点，具有较高的工业应用价值。来源于Fervidobacterium nodosum的FnCel5A是一个嗜热内切葡聚糖酶，通过对其结晶结构的分析，冯雁教授课题组对极端嗜热葡聚糖酶的催化机制及耐热机制进行了深入研究［34］。以FnCel5A作为催化结构域，进一步建立了对CBM非水解破坏功能的定量方法［35］。

3 结论及展望

极端嗜热厌氧菌以其高温、强纤维素降解能力成为人们的研究热点。Caldicellulosiruptor属菌株是嗜热厌氧菌中的代表，具有丰富的、耐高温的纤维素酶，能够提供理论研究或工业生产中需要的大量酶资源。木质纤维素材料具有极强的生物抗屏障性，能够抵制纤维素酶的降解，寻找高效降解未预处理木质纤维素的酶，具有重要的工业应用意义。Caldicellulosiruptor属菌株具有底物利用范围广、能高效降解未预处理的木质纤维素、发酵过程中无碳代谢抑制等优点。如何深入探索Caldicellulosiruptor属菌株嗜热酶及其高效利用未预处理木质纤维素的机制，并对其进行工业应用挖掘，是亟待解决的问题。随着基因组、转录组及蛋白质组的研究工作深入，尤其是遗传转化平台的建立，为进一步从分子水平上了解和改造嗜热厌氧菌，促使其成为CBP发酵细胞工厂平台系统提供坚实的基础。

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