丝状真菌降解转化纤维素的机制与遗传改良前景

钟耀华，钱远超，任美斌，汪天虹

(山东大学 生命科学学院 微生物技术国家重点实验室，济南 250100)

纤维素是植物在光合作用过程中利用太阳能和CO2形成的产物，是地球上生物量最大的可再生资源，年产量达7.2 ×1010t［1］。将纤维素材料降解为可发酵糖，然后转化为乙醇(第二代生物乙醇)，已经成为公认的可替代化石燃料的可再生性能源途径。纤维素是由葡萄糖单元以β-1，4-糖苷键连接起来的同质高聚物。自然界中，纤维素生物质的降解是由被称为纤维素酶的多种酶类混合物共同完成的。包括真菌和细菌在内的许多微生物可以降解纤维素和其他植物细胞壁纤维，其中丝状真菌可以通过分泌大量纤维素酶来有效降解纤维素，是目前工业上用于纤维素酶生产的主要微生物来源［2］。

纤维素酶应用广泛，在工业酶市场中纤维素酶占据了重要的份额。在制浆造纸、纺织和食品及饲料工业中，纤维素酶占到了总酶需求量的75%。然而，在全世界总酶市场中，目前纤维素酶已占到了近20%的份额，随着生物炼制特别是纤维素乙醇产业的快速发展，这个比例将会大大增加［2］。生物炼制上的主要问题是酶的成本，为了使得纤维素乙醇燃料计划能够成功实行，纤维素酶的价格必须是合理的［3］。通常，纤维素酶的成本占到纤维素乙醇生产总成本的40% ～49%［4］。在过去的几年中，纤维素酶生产的价格宣称已降低了10倍，每生产3.78 L(1加仑)乙醇的纤维素酶价格在10～20美分(约0.6 ～1.2 元)［5］。在一个反应器或工程微生物中实现产酶、糖化和发酵同时进行(称为统合生物加工，CBP)，可以进一步降低成本生产“经济乙醇”，理论上纤维素酶成本可降低到约0.06元/L(4.2美分/加仑乙醇)［2］。但最近的估算并不乐观，纤维素酶成本大约在0.714元/L(50美分/加仑)纤维素乙醇［6］。如何降低纤维素酶的生产成本已成为生物炼制产业尤其是纤维素乙醇产业中的一个重要瓶颈。

对木质纤维素生物燃料生产的极大需求激发了纤维素酶研究的新一轮热潮。由于在生物化学、分子生物学、系统生物学、结构生物学和生物工程学上的技术进步，整体上纤维素酶生物技术取得了显著进展。利用纤维素酶提高生物炼制的关键是寻找或构建能够高产高效纤维素酶的工业菌株。传统突变筛选、原生质体融合、蛋白质工程(包括理性设计与定向进化)以及建立纤维素酶检测方法等方面都取得了良好的效果，也进行了很好的综述［7-8］。近年来，一些重要纤维素降解真菌，如Trichoderma reesei(瑞氏木霉，亦称里氏木霉)［9］、Penicillium oxalicum(草酸青霉，原名斜卧青霉)［10］等基因组测序完成以及在开发降解纤维素的新酶组分和协同因子领域的进展为改良菌株提供了新的可能方向。本文中笔者将在总结真菌纤维素酶及作用机制的基础上，讨论系统生物学在新酶发现的应用，并着重探讨提高丝状真菌酶系效率和产量的改良策略。

1 生产纤维素酶的丝状真菌

能合成分泌纤维素酶的真菌是广泛存在的，包括子囊菌中的木霉(如T.reesei)和青霉(如P.oxalicum)等、担子菌中的白腐真菌(如黄孢原毛平革菌Phanerochaete chrysosporium)和褐腐真菌(如癞拟层孔菌Fomitopsis palustris)等以及一些在瘤胃动物消化道中的厌氧真菌(如根囊鞭菌 Orpinomyces sp.)［2］。在工业生产上广泛应用的是来自子囊菌的丝状真菌类群。长期以来，木霉属真菌(如 T.reesei、T.viride和T.longibrachiatum)被认为是最有效和强大的结晶纤维素的降解菌［11］。其中，T.reesei突变株是目前许多酶制剂大公司进行工业化生产纤维素酶制剂的菌株［12］。由此，绝大多数纤维乙醇研究发展规划关注在T.reesei纤维素酶上。随着越来越多的研究发现，Penicillium、Acremonium(顶孢霉)和 Chrysosporium(金孢子菌)等也可与T.reesei媲美，具有一些重要的特征，如蛋白产量高、比活力高等优点［13］。

T.reesei的发现可以追溯到二战时期。为了寻找军用帆布快速腐烂的原因，最终分离并鉴定出T.viride QM 6a，随后进一步筛选出了高效纤维素水解能力的突变菌株QM9414、RUT C30等。为了纪念Reese在1940代发现该菌，1977年该菌被命名为T.reesei［1］。Mandels等［14］搜集和筛选了超过1 400种真菌，发现没有1种真菌产纤维素酶能超过T.reesei。在工业发酵中，曲霉属的 Aspergillus niger(黑曲霉)等常作产酶菌种［15］，尽管曲霉属菌种具有编码内切葡聚糖酶和纤维二糖水解酶的基因，但是它们主要用来生产半纤维素酶和果胶酶，所以一般不作为纤维素酶的生产菌株。Humicola insolens(特异腐质霉)是另一种纤维素酶工业生产菌株［11］，但该菌生产的纤维素酶不是用于纤维素糖化，而是用于制浆造纸和纺织品的处理等［16］。尽管H.insolens能够高效降解结晶纤维素(超过50%)，但其水解效率很难与 T.reesei比较［11］。

青霉属真菌可以作为T.reesei的替代菌株用于第二代生物乙醇的生产。青霉属的纤维素酶制剂与T.reesei相比有一定的优点，例如青霉属的胞外纤维素酶系含有高β-葡萄糖苷酶活力，在等滤纸酶活力(FPU)条件下，降解木质纤维素时产生的葡萄糖是 T.reesei的 1.5 ～3 倍［13］。即使在相同的β-葡萄糖苷酶用量和相同的纤维素酶活条件下，青霉属的酶系也比T.reesei的要优［17］。青霉属高效水解的原因是有高比酶活的 GH7——纤维二糖水解酶(CBH I)。在相同蛋白量下与 Acidothermus cellulolyticus(嗜酸栖热菌)内切葡聚糖酶配合，P.verruculosum(疣孢青霉)的CBH I对玉米秸秆和微晶纤维素的转化率是 T.reesei CBH I的1.3～1.5倍［18］。虽然没有直接比较过青霉 P.occitanis和T.reesei的CBH I水解能力，但是 P.occitanis的 CBH I受天然纤维二糖的抑制比T.reesei的CBH I小得多，这可能是因为P.occitanis的CBH I具有少量的氢键和多变的活性位点［19］。

在木质纤维素糖化过程中，A.cellulolyticus(解纤维顶孢霉)也有可能是 T.reesei的替代菌株。Ikeda等［20］研究发现 A.cellulolyticus 发酵液水解废纸和废木屑效果要优于2种T.reesei的商品酶——Genencor公司的 GC220和 HIB公司的 Cellulosin T2。日本明治制果(MeijiSeika)公司的A.cellulolyticus商品酶制剂在相同蛋白量下处理不同的木质纤维素材料，葡萄糖得率都比Genencor公司的T.reesei商品酶Accellerase 1 000高，这可能是A.cellulolyticus对抑制物的敏感度比 T.reesei低［21］。为了寻找更好的纤维素酶来生产生物乙醇，研究者发现了许多新的高活力的纤维二糖水解酶。来自A.thermophilum(嗜 热 顶 孢 霉 )、Chaetomium thermophilum(嗜热毛壳菌)和 Thermoascus aurantiacus(嗜热子囊菌)的重组GH7(纤维二糖水解酶)表现出比T.reesei CBH I更高的热稳定性(高4～10 ℃)和高比活力［22］。

金孢子菌Chrysosporium lucknowense的CBH Ia(Cel7A)和CBH IIb(Cel6B)在水解微晶纤维素120 h与T.reesei的CBH I具有相当的效果，其中CBH Ia活力比TrCBH I稍低，而CBH IIb比TrCBH I效率高。当将C.lucknowense的纤维素酶系进行重新组合后获得了比 T.reesei 2种商业酶 Celloviridin G20x和 BioAce具有更高的糖化效率［23］。向C.lucknowense纤维素酶系中添加无碳水化合物结合模块(CBM)的 EG V(Cel45A)和 CBH 1b(Cel7B)可进一步提高对预处理冷杉木材底物水解的协同作用［23］。从商品酶的角度比较，Dyadic公司的e酶制剂ArternaFuel C1(来源于C.lucknowens)具有与最新遗传改良的T.reesei酶制剂Cellic®CTec或Accellerase 1000和1500相当的水解性能(参见http:∥dyadic.com/c1/)。

2 降解纤维素的酶类组成

纤维素酶采用保留机制或反转机制2种不同的催化方式来水解纤维素中的β-1，4-糖苷键。例如，所有GH12纤维素酶采用保留机制水解糖苷键，而GH6纤维素酶采用反转机制［24］。2种催化机制都利用2个起催化作用的羧基氨基酸残基，并通过酸碱催化方式反应。内切纤维素酶(EG)水解纤维素链内部的糖苷键，而外切纤维素酶(CBH)作用于链的两端，产物主要是纤维二糖，然后进一步被第三类酶β-葡萄糖苷酶(BGL)水解成葡萄糖。大多数纤维素酶具有一个小的独立折叠的CBM，CBM通过一个弹性的连接区(linker)与催化结构域(CD)连接。CBM负责将酶结合到结晶纤维素上，从而提高酶的活力。真菌纤维素降解酶的分类及主要特征总结在表1中。

2.1.1 内切纤维酶

内切纤维素酶(EC 3.2.1.4，内切-1，4-β-葡聚糖酶，EG)，也称为羧甲基纤维素酶(CMCase)，它可利用人工底物羧甲基纤维素(CMC)来检测内切酶活力。EG通过攻击纤维素中的无定形区来促进纤维素的降解，这为纤维二糖水解酶提供新的自由末端从而加速水解。真菌EG通常具有比较宽的底物结合裂缝作为催化活性中心。大多数EG的最佳pH范围为4.0 ～5.0、最佳温度范围为50 ～70 ℃(表1)。许多真菌产生多种EG［13］。例如，T.reesei产生至少6种EG(EG I/Cel7B、EG II/Cel5A、EG III/Cel12A、EG V/Cel45A、Cel74A 和 Cel5B)［1］，而 在 白 腐 真 菌P.chrysosporium中分离到3种 EG(EG28、EG34和EG44)［25］。另外，一些EG缺少CBM，而另一些具有CBM。例如，T.reesei的 EG I、EG II和 EG V 具有CBM，而 EG III则没有 CBM 区［26］。

2.1.2 外切纤维素酶

纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.91，纤维二糖水解酶，CBH)从纤维素末端水解 β-1，4-糖苷键，在结构上利用延伸的环(loop)形成一个底物结合桶，(tunnel)将纤维素环绕起来。与EG类似，CBH的最佳pH范围为4.0～5.0，但最佳温度范围比较宽，30～60℃。有的CBH作用于纤维素链的非还原端，而另一些是从还原端作用，这样，在2种相反作用方式的酶之间可以提高协同效应。例如，T.reesei具有2种CBH:作用于非还原端的CBH II/Cel6A和还原端的CBH I/Cel7A，从而产生了更有效的纤维素降解能力［11］。T.reesei的2种 CBH 分别在 C端和N段具有CBM［1］。CBH在降解纤维素时的一个重要特点是持续性降解，它可以沿着纤维素链前进，不断地释放水解产物——纤维二糖。CBH的终产物纤维二糖起到竞争性抑制因子的作用，能够限制体系内酶对所有纤维素分子的降解［26］。

2.1.3 β-葡萄糖苷酶

β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21，BGL)，将可溶性纤维二糖和纤维寡糖水解成葡萄糖，因此也会被葡萄糖竞争性抑制。根据氨基酸序列，BGL属于GH1和GH3家族［1］。2个家族的BGL都利用保留机制水解β-1，4-糖苷键。BGL由于其结构和定位上的差异，在纤维素降解酶中是变化最多的。一些BGL是相对分子质量在3.5×104左右的简单单体结构(如侧耳 Pleurotus ostreatus的 BGL［27］)，而另一些是相对分子质量在1.5×105的二聚体结构(如掷孢酵母 Sporobolomyces singularis的 BGL［28］)或者相对分子质量超过4.5×105的三聚体结构(如彩色豆马勃Pisolithus tinctorius的 BGL)［29］。根据定位方式，BGL可分为3种类型，胞内的、细胞壁相连的和胞外的，其最佳pH受定位方式的影响较大，最佳温度范围45～75℃。从T.reesei培养上清中分离了2种BGL(BGLI/Cel3A和BGLII/Cel1A)，但是它们主要与细胞壁相连［30］。

表1 丝状真菌纤维素水解酶的类别及主要特征Table 1 The types of hydrolytic enzymes for cellulose degradation and the related features

2.1.4 降解纤维素的新酶组分与降解机制新模型

以上描述的3类降解纤维素的酶类都是水解酶，它们通过增加1个水分子水解葡萄糖苷键。尤其是外切酶CBH，对于持续性降解纤维素晶体部分可能是非常重要的。然而，纤维素是紧密包裹的晶体结构，完全依靠这种持续性的糖苷水解酶的单链酶解，效率很慢，要进行有效水解就需要相当大的酶量，例如T.reesei的外切酶CBH I和CBH II就占到总分泌蛋白量的80%以上。自从半个世纪前研究纤维素酶开始，Reese就提出可能存在使得纤维素晶体底物更容易降解的其他因子［31］。几年前，诺维信(Novozymes)公司为了鉴定与T.reesei酶系产生协同作用的新蛋白质时，从太瑞斯梭壳孢霉(Thielavia terrestris)中分离并证实了GH61蛋白是产生协同作用的新纤维素酶组分［32］。大多数GH61没有水解活性，然而一些GH61在二价金属离子及还原剂存在时，可以显著减少木质纤维素生物素水解所需要的纤维素酶量，不仅可以提高纤维素转化速率，而且对转化效率也有极大地提高［32］。最开始这一类酶被CAZy数据库(carbonhydrate-activity enzymes database)划分为GH61家族，因为其中的一个成员具有微弱的内切葡萄糖苷酶的活性。这些酶实际上具有多糖单加氧酶(polysaccharide monooxygenase，PMO)的活性，因此，这些酶并不是真正的糖苷水解酶。之所以仍然把它们归在CAZy分类里，是因为它们可以极大地促进传统的纤维素酶对木质纤维素的降解［33］。另外，GH61表达也是受到纤维素的诱导，与其他的纤维素酶的表达共同调控［34］。在有氧条件下，PMO作用于PASC才能生产被氧化的多糖。这一现象表明PMO是一个氧化酶。同时，PMO也是一个金属酶，需要二价金属离子才能发挥催化作用。用Cu2+依赖的氧化酶氧化降解纤维素的研究为纤维素降解机制提出了新的观点。PMO氧化酶拥有平坦的底物结合位点，可以附着在纤维素底物平坦的结晶表面发挥氧化作用，在底物上产生一个切口，将纤维素的高度结晶区打开，从而为其他水解酶如CBH提供水解的靶点，从而起到了显著的协同作用［35］。这些最新的研究成果提供了一种多糖单加氧酶辅助传统纤维素水解酶共同降解纤维素机制的新模型(图1)。

图1 丝状真菌纤维素酶系降解纤维素机制的新模型Fig.1 Novel mechanism of cellulose degradation by filamentous fungi

3 组学时代对丝状真菌高效纤维素机制的探索和协同因子的发掘

T.reesei作为最具代表性的纤维素降解真菌，对其全基因组的测序为系统解析该菌降解纤维素的机制以及了解其降解性能优缺点提供了契机［9］。在最初的大规模cDNA测序中，与纤维素酶同时高表达的2个编码CIP I和CIP II的基因是新发现的含有CBD的蛋白，进一步，CIP I被确定为葡糖醛酸酯酶(GE)［35］。全基因组测序后发现，T.reesei基因组比其他纤维素降解菌基因组具有更少的纤维素降解酶编码基因，虽然在T.reesei基因组有8种(6种内切葡聚糖酶，2种纤维二糖水解酶)编码分属不同糖苷水解酶家族的纤维素酶基因，但是，一般只表达4种主要的纤维素酶:CBH I(Cel7A)、CBH II(Cel6A)、EG I(Cel7B)和 EG II(Cel5A)，占总蛋白的90% ～95%［1］。同时，该基因组中不具有编码纤维二糖脱氢酶(CDH)、内切-β-1，4-半乳聚糖酶(GAL)、阿魏酸酯酶(FAE)、果胶裂解酶(PL)以及果胶酯酶(PE)等基因，这也为进一步提高T.reesei降解木质纤维素效率提供了改良的可能靶点。最近对另一种高效降解木质纤维的Myceliophthora thermophila(嗜热毁丝霉)的基因组测序发现，该菌基因组比T.reesei基因组含有更多的多糖单加氧酶(PMO，也称为GH61蛋白)基因和结合CBM蛋白的基因［36］。另外，草酸青霉(原称“斜卧青霉”)是山东大学筛选到的比T.reesei具有更高BGL活力且产酶周期短的丝状真菌，基因组测序结果显示，该菌比T.reesei具有数量更多、种类更丰富的木质纤维素降解酶［37］。从上述基因组水平的分析可以发现，一种真菌并不能产生所有降解纤维素的酶类，这也为进一步改良菌种提供了分子水平的依据。

从蛋白质组水平上分析特定生长条件下丝状真菌分泌酶类的整体情况，将会更加直观地了解降解纤维素底物时的实际酶系组成和比例。对T.reesei分泌酶类的系列蛋白组学研究表明，该酶系组成中，CBH I和 CBH II占总蛋白量的50% ～80%，EG占到15% ～20%，而木葡聚糖酶(XG)含量为1% ～10%［38］。在不同底物上生长时，T.reesei的分泌酶类情况也不同，例如，以预处理玉米秸秆(PCS)为底物时，主要分泌蛋白为CBH、木葡聚糖酶(XG)和EG;而以CMC为底物时，分泌酶类主要是CBH、EG、淀粉酶(AMY)和 阿拉伯呋喃糖苷酶(ABF)［38］。草酸青霉在纤维素和麸皮培养基中培养时，分泌的主要酶类是 AMY、CBH、果胶酶(PEC)、PMO、EG 和 XYN［37］。粗糙脉孢菌 N.crassa在纤维素上生长时，也分泌大量多糖单加氧酶［39］。这些蛋白组分析结果为设计高效纤维素酶系复合物提供了重要的酶谱数据参考。

借助蛋白组分析来筛选不同纤维素降解酶系之间的协调因子是一个具有良好前景的策略。上述T.reesei酶系协调因子GH6蛋白的鉴定，是基于这一蛋白的特定协调效应来进行的逐级组分分离。当不同菌株之间多组分协同或不同酶类间协同作用时，蛋白组学分析手段就是一个有效的选择。最近一些研究表明，许多植物致病菌如 Fusarium verticillioides(镰刀霉)、Ustilago maydis(玉米黑粉菌)和白腐真菌Trametes gibbosai(褶孔栓菌)的酶系与T.reesei酶系在降解木质纤维素材料时具有良好的协调效应。F.verticillioides的分泌组分析结果表明该酶系含有丰富的β-木糖苷酶(BX)、阿拉伯呋喃糖苷酶(ABF)和果胶酶［40］。而在 U.maydis分泌组中，半纤维素酶类和葡萄糖-甲醇-胆碱氧化还原酶(GMC)是最主要的组分［41］。T.gibbosa 所分泌的酶类比T.reesei酶系在晶体纤维素上表现出更高的水解活力，而已知T.gibbosa仅含有很少量的纤维素降解酶［42］。因此，要解析其高效水解能力，需要利用蛋白组分析来阐明具体酶类组成，亦可以进一步寻找与T.reesei酶系协同降解纤维素的因子。

4 提高纤维素酶酶解效率和产量的改良策略

为了提高纤维素酶高效率降解转化纤维素材料的目的，一方面需要寻找或利用蛋白工程获得具有更高活力或特性的单酶组分，另一方面则是提高菌株产酶水平和整体酶系效率。前者主要是蛋白性质与工程的研究，已有大量综述进行总结，同时，突变筛选、菌株融合等传统方法也比较常用，所以，在此笔者主要对最近比较关注的降解酶系优化、高效表达平台构建、基因表达调控以及蛋白分泌改造等方面进行探讨。

4.1 酶系组分优化改造

真菌共培养是一种可提高木质纤维素材料水解效率进行酶系优化的策略。例如，纤维素降解过程中，3种主要酶组分EG、CBH和BGL需求都比较大，但是没有真菌菌株能够同时生产高水平的3种酶。例如，T.reesei可生产大量CBH和EG，但它的BGL活力很低［43］。为提高 T.reesei BGL的活力，一些成功的尝试已经开展，如利用T.reesei的 xyn3和egl3的启动子同源过表达 BGL I，将BGL活力分别提高了4倍和7.5倍［44］。另外，当木质纤维素材料转化时，也需要考虑半纤维素的水解。这主要是由预处理方法决定的。在碱法预处理过程中，部分木质素被除去，这样半纤维素就必须用半纤维素酶来降解，而酸催化的预处理中，半纤维素会被除去。一些真菌会对纤维素降解更有效，而另一些真菌产生更多的半纤维素酶降解半纤维素。通过共培养两种或多种匹配的微生物可以同时高效水解纤维素和半纤维素。事实上，在自然界中，木质纤维素材料是被多种共存的纤维素降解微生物共同降解的。共培养两种或多种真菌进行发酵是抗生素、酶及发酵食品生产等许多生物过程广泛采用的策略。与单菌培养相比，混合真菌培养具有许多优点，包括提高产量、适应性和底物利用率。共培养T.reesei和黑曲霉提高真菌纤维素降解能力已被广泛研究［29］。共培养的主要缺点是在同一培养基中生长多个微生物的复杂性。

对天然纤维素降解酶系进行理性添加所需酶类也是一种有效策略。例如，T.reesei不具有阿魏酸酯酶和纤维二糖脱氢酶，把其他来源的这2种酶直接补加到T.reesei酶系中可以显著提高木质纤维素的转化效率［45］。为了提高T.reesei对含有半纤维素酶组分的材料进行有效降解，将Podospora anserina(柄孢霉)的5种半纤维素酶添加到T.reesei酶系中，发现2种甘露聚糖酶可以显著提高糖化效率［46］。同样，许多来源不同并含有木聚糖酶、果胶酶、葡萄糖苷酶和阿魏酸酯酶等的粗酶复合物，尽管它们的纤维素酶活力很低或几乎没有，但能够有效地促进T.reesei酶系催化效率［37］，以预处理玉米秸秆的糖化效率为标准，通过系列组合实验，获得了仅由少数“核心酶”和“辅助酶”构成的组合酶系，可与含有80多种蛋白的商品酶媲美［47］。这些研究说明，通过对酶系进行优化组合可以进一步提高纤维素转化效率。

4.2 异源表达平台构建

异源表达是提高酶产量和酶活力，并直接获得改良菌株的有效策略。各种基因工程方法如强启动子控制、表达融合蛋白、缺失蛋白酶活力等提高重组蛋白表达的技术已比较成熟，为丝状真菌高效生产异源纤维素酶奠定了基础［48］。T.reesei的低BGL活力的情况可以通过同源或异源过表达BGL来改良，如利用内源CBH I强启动子同源过表达BGL可以提高30%以上的糖化效果［49］，而过表达来自草酸青霉的BGL可以提高糖化效果达150%［43］。另外，为了构建强大的木质纤维素降解真菌，许多具有高活力或特殊性质的不同真菌纤维素酶被克隆和表达。例如，来自嗜热真菌T.emersonii的热稳定的 BGL/cel3a 在 T.reesei中利用CBH I启动子进行表达，获得了高热稳定性(最佳温度为71.5 ℃)和高比活力［50］。T.reesei的纤维二糖水解酶I和II(CBH I和CBH II)可利用CBH I启动子进行额外多拷贝表达，CBH I提高了1.3倍(1个多拷贝)和1.5倍(2个多拷贝)，而CBH II在多1个拷贝数的情况下提高了3～4倍，从而都改善了对纤维素底物的转化效果［51］。另外，利用DNA重组技术设计具有特殊应用的嵌合蛋白已经被应用。例如，来自Acidothermus cellulolyticus的1个内切酶与 T.reesei CBH I融合表达在 T.reesei中，这个双功能的内切和外切酶能够提高糖化产量［52］。要实现丝状真菌对异源纤维素酶的高效表达，不可避免遇到的瓶颈是表达量低，这现象主要存在于蛋白分泌途径中，异源蛋白不能完成正确的折叠和成熟，或不能顺利穿过分泌途径，从而在细胞内被部分降解或完全降解，这方面的研究正在起步阶段。建立起丝状真菌异源表达平台将是获得高产高效纤维素酶菌株的一个重要途径。

4.3 基因表达调控和蛋白分泌途径的改良前景

基因工程和蛋白工程手段改良菌株主要是提高了单酶组分的产量或酶活力。从基因表达调控水平上进行改造，甚至仅改造一个调控因子则可以实现调控某个途径整体表达变化。这种策略已成功用在酿酒酵母生物燃料生产的改良上。例如，利用易错PCR方法对转录因子Spt15进行突变从而提高了酵母对乙醇的耐受性［53］。这说明对单个细胞蛋白的改变就可以实现复杂表型的改良。实际上，T.reesei高产突变株Rut C30和草酸青霉JU-A10的代谢阻遏解除都是因为对单个转录抑制因子CRE I/CreA的突变造成的［36］。对RUT C30菌株遗传差异分析和基因组测序得知cre1基因被截短，而对草酸青霉JU-A10基因组测序发现CreA基因的1205位缺失一个碱基“C”，从而造成该基因的移码突变。在进一步改造纤维素酶基因表达调控方面，通过敲除转录抑制因子ACEI或CRE I、过表达激活因子XlnR或LAE I甚至组合改造相关转录因子，已经一定程度上实现了纤维素酶基因转录水平的增加，并提高了胞外纤维素酶的产量［36］。这些工作表明:在促进产纤维素酶的菌株遗传工程中，转录调控蛋白是潜在有效的改良靶标。

构建高产纤维素酶菌株的一个基本目标就是使酶蛋白大量分泌到细胞外。目前，工业丝状真菌一般都具有高水平蛋白分泌能力，如T.reesei的最好突变株可以分泌100 g/L的胞外蛋白。但是，当表达异源蛋白/酶时，产量往往很低，即使采用强启动子等策略也达不到目标。这主要是因为:过量表达的异源蛋白超出细胞承受能力，多肽链不能及时正确折叠，在内质网引起非折叠蛋白响应(UPR)并进一步导致内质网相关蛋白降解(ERAD)，严重影响了蛋白的顺利转运和分泌。一个经典例子就是，在构巢曲霉 A.niger中表达异源白腐菌 Trametes versicolor虫漆酶和植物甜蛋白(Thaumatin)，这2个蛋白的初始产量都很低，但在过量表达UPR响应特异转录因子hac1持续激活UPR后，使得异源虫漆酶产量提高了7倍，而甜蛋白产量提高了 2.8倍［54］。最近，Idiris等［55］系统总结了遗传改造蛋白分泌途径的不同阶段，包括蛋白折叠、糖基化、囊泡转运等，提高异源蛋白(包括纤维素酶)产量的基本原理和进展。总之，改良蛋白质分泌途径也是实现纤维素酶系优化和改良的重要策略。

5 总结与展望

丝状真菌作为自然界中高效降解纤维素材料的微生物类群，一方面在促进C源循环方面起到了重要作用，另一方面，在工业上也已经成为纤维素酶的主要生产者，在为人类利用可再生性纤维素资源转化生物燃料等化学品方面具有特殊重要的地位。深入了解丝状真菌产纤维素酶多样性，将为挖掘丝状真菌在降解转化纤维素材料上的巨大潜力奠定基础。而随着基因组学、转录组学和蛋白组学等系统生物学技术手段的快速发展，将会不断地深入解析丝状真菌产酶变化及降解纤维素的具体机制，为产酶菌株改良和酶系优化提供重要的参考和规范。纤维素酶蛋白工程、酶系组分改造、新酶组分的发现以及高效纤维素酶表达系统构建，将会获得对各种不同纤维素底物降解效率更高、性能更优良的工程菌株，从而提高纤维素酶的效率和产量，最终降低纤维乙醇等生物化学品的生产成本，使得地球上生物量最大的可再生性纤维素资源转化为社会发展需要的生物燃料和化学品，而服务于人类社会。

［1］ Kubicek C P，Mikus M，Schuster A，et al.Metabolic engineering strategies for the improvement of cellulase production by Hypocrea jecorina［J］.Biotechnol Biofuels，2009，2:19.doi:10.1186/1754-6834-2-19.

［2］ Chandel A K，Chandrasekhar G，Silva M B，et al.The realm of cellulases in biorefinery development［J］.Crit Rev Biotechnol，2012，32(3):187-202.

［3］ Regalbuto J R.Cellulosic biofuels:got gasoline［J］.Science，2009，325:822-824.

［4］ Lynd L R，van Zyl W H，McBride J E，et al.Consolidated bioprocessing of cellulosic biomass:an update［J］.Curr Opin Biotechnol，2005，16(5):577-583.

［5］ Greer D.Spinning straw into fuel［J］.Biocycle，2005，46(4):61-65.

［6］ Wilson D B.Cellulases and biofuels［J］.Curr Opin Biotechnol，2009，20(3):295-299.

［7］ Percival Zhang Y H，Himmel M E，Mielenz J R.Outlook for cellulase improvement:screening and selection strategies［J］.Biotechnol Adv，2006，24(5):452-481.

［8］ Himmel M E，DingSY，JohnsonD K，etal.Biomass recalcitrance:engineering plants and enzymes forbiofuels production［J］.Science，2007，315:804-807.

［9］ Martinez D，Berka R M，Henrissat B，et al.Genome sequencing and analysis of the biomass-degrading fungus Trichoderma reesei(syn.Hypocrea jecorina)［J］.Nat Biotechnol，2008，26(5):553-560.

［10］ Liu G，Zhang L，Wei X，et al.Genomic and secretomic analyses reveal unique features of the lignocellulolytic enzyme system ofPenicillium decumbens［J］.PLoSOne，2013，8(2):e55185.doi:10.1371/journal.pone.0055185.

［11］ Lynd L R，Weimer P J，van Zyl W H，et al.Microbial cellulose utilization:fundamentals and biotechnology［J］.Microbiol Mol Biol Rev，2002，66(3):506-577.

［12］ Margeot A，Hahn-Hägerdal B，Edlund M，et al.New improvements for lignocellulosic ethanol［J］.Curr Opin Biotechnol，2009，20(3):372-380.

［13］ Gusakov A V.Alternatives to Trichoderma reesei in biofuel production［J］.Trends Biotechnol，2011，29(9):419-425.

［14］ Mandels M，Sternberg D.Recent advances in cellulase technology［J］.J Ferment Technol，1976，54(4):267-286.

［15］ de Vries R P，VisserJ.Aspergillusenzymesinvolved in degradation of plant cell wall polysaccharides［J］.Microb Mol Biol Rev，2001，65(4):497-522.

［16］ Schülein M.Enzymatic properties of cellulases from Humicola insolens［J］.J Biotechnol，1997，57(1/2/3):71-81.

［17］ Berlin A，Gilkesa N，Kilburn D，et al.Evaluation of novel fungal cellulase preparations for ability to hydrolyze softwood substrates:evidence for the role of accessory enzymes［J］.Enzyme Microb Technol，2005，37(2):175-184.

［18］ Morozova V V，Gusakov A V，Andrianov R M，et al.Cellulases of Penicillium verruculosum［J］.Biotechnol J，2010，5(8):871-880.

［19］ Bhiri F，Gargourib A，Ali M，et al.Molecular cloning，gene expression analysis and structural modeling of the cellobiohydrolase I from Penicillium occitanis［J］.Enzyme Microb Technol，2010，46(2):74-81.

［20］ Ikeda，Y，HayashiH，Okuda N，etal.Eff i cientcellulase production by the f i lamentous fungus Acremonium cellulolyticus［J］.Biotechnol Prog，2007，23(2):333-338.

［21］ FujiiT，Fang X，Inoue H，etal.Enzymatic hydrolyzing performance of Acremonium cellulolyticus and Trichoderma reesei against three lignocellulosic materials［J］.Biotechnol Biofuels，2009，2(1):24.doi:10.1186/1754-6834-2-24.

［22］ Voutilainen S P，Puranen T，Siika-Aho M，et al.Cloning，expression，and characterization of novel thermostable family 7 cellobiohydrolases［J］.Biotechnol Bioeng，2008，101(3):515-528.

［23］ Gusakov A V，Salanovich T N，Antonov A I，et al.Design of highly eff i cient cellulasemixtures for enzymatic hydrolysis of cellulose［J］.Biotechno Bioeng，2007，97(5):1028-1038.

［24］ Bayer E A，Chanzy H，Lamed R，et al.Cellulose，cellulases and cellulosomes［J］.Curr Opin Struct Biol，1998，8(5):548-557.

［25］ Baldrian P， Valásková V.Degradation of cellulose by basidiomycetous fungus［J］.FEMS Microbiol Rev，2008，32(3):501-521.

［26］ Sukharnikov L O，Cantwell B J，Podar M，et al.Cellulases:ambiguous nonhomologous enzymes in a genomic perspective［J］.Trends Biotechnol，2011，29(10):473-479.

［27］ Morais H，Ramos C，Matos N，et al.Liquid chromatographic and electrophoretic characterisation of extracellular beta-glucosidase of Pleurotus ostreatus grown in organic waste［J］.J Chromatogr B，2002，770:111-119.

［28］ Ishikawa E，Sakai T，Ikemura H，et al.Identification，cloning，and characterization of a Sporobolomyces singularis beta-galactosidaselike enzyme involved in galacto-oligosaccharide production［J］.J Biosci Bioeng，2005，99:331-339.

［29］ Dashtban M，SchraftH，Qin W.Fungalbioconversion of lignocellulosic residues:opportunities ＆ perspectives［J］.Int J Biol Sci，2009，5(6):578-595.

［30］ Kubicek C P.Release ofcarboxymethyl-cellulase and βglucosidase from cell walls of Trichoderma reesei［J］.Eur J Appl Microbiol Biotechnol，1981，13(4):226-231.

［31］ Reese E T.Enzymatic hydrolysis of cellulose［J］.Appl Microbiol，1956，4(1):39-45.

［32］ Merino S T，CherryJ.Progress and challenges in enzyme development for biomass utilization［J］.Adv Biochem Eng Biotechnol，2007，108:95-120.

［33］ Horn S J，Vaaje-Kolstad G，Westereng B，et al.Novel enzymes for the degradation of cellulose［J］.Biotechnol Biofuels，2012，5(1):45.doi:10.1186/1754-6834-5-45.

［34］ Vaaje-Kolstad G，Westereng B，Horn S J，et al.An oxidative enzyme boosting the enzymatic conversion ofrecalcitrant polysaccharides［J］.Science，2010，330:219-222.

［35］ Foreman P K，Brown D，Dankmeyer L，et al.Transcriptional regulation of biomass-degrading enzymes in the f i lamentous fungus Trichoderma reesei［J］.J Biol Chem，2003，278:31988-31997.

［36］ Peterson R，Nevalainen H.Trichoderma reesei RUT-C30:thirty years of strain improvement［J］.Microbiology，2012，158(1):58-68.

［37］ Liu G，Qin Y，Li Z，et al.Development of highly efficient，low-cost lignocellulolytic enzyme systems in the post-genomic era［J］.Biotechnol Adv，2013，31(6):962-975.

［38］ Chundawat S P，Lipton M S，Purvine S O，et al.Proteomics-based compositional analysis of complex cellulase-hemicellulase mixtures［J］.J Proteome Res，2011，10(10):4365-4372.

［39］ Phillips C M，Iavarone A T，Marletta M A.Quantitative proteomic approach for cellulosedegradation by Neurospora crassa［J］.J Proteome Res，2011，10(9):4177-4185.

［40］ Ravalason H，Grisel S，Chevret D，et al.Fusarium verticillioides secretomeas a source ofauxiliary enzymes to enhance saccharif i cation of wheat straw［J］.Bioresour Technol，2012，114:589-596.

［41］ Couturier M，Navarro D，Olive C，et al.Post-genomic analyses of fungal lignocellulosic biomass degradation reveal the unexpected potential of the plant pathogen Ustilago maydis［J］.BMC Genomics，2012，13:57.doi:10.1186/1471-2164-13-57.

［42］ Berrin J G，Navarro D，Couturier M，et al.Exploring the natural fungal biodiversity of tropical and temperate forests toward improvement of biomass conversion［J］.Appl Environ Microbiol，2012，78:6483-6490.

［43］ Ma L，Zhang J，Zou G，et al.Improvement of cellulase activity in Trichoderma reeseiby heterologous expression ofa betaglucosidase gene from Penicillium decumbens［J］.Enzyme Microb Technol，2011，49(4):366-371.

［44］ Rahman Z，Shida Y，Furukawa T，etal.Application of Trichoderma reesei cellulase and xylanase promoters through homologous recombination for enhanced production of extracellular beta-glucosidase I［J］.Biosci Biotechnol Biochem，2009，73(5):1083-1089.

［45］ Bey M，Berrin J G，Poidevin L，et al.Heterologous expression of Pycnoporus cinnabarinuscellobiose dehydrogenase in Pichia pastoris and involvement in saccharif i cation processes［J］.Microb Cell Fact，2011，10:113.doi:10.1186/1475-2859-10-113.

［46］ CouturierM，Haon M，CoutinhoP M.Podospora anserina hemicellulases potentiate the Trichoderma reesei secretome for saccharif i cation of lignocellulosic biomass［J］.Appl Environ Microbiol，2011，77(1):237-246.

［47］ Banerjee G，Car S，Scott-Craig J S，et al.Synthetic multicomponent enzyme mixtures for deconstruction of lignocellulosic biomass［J］.Bioresour Technol，2010，101(23):9097-9105.

［48］ 钟耀华，王晓利，汪天虹.丝状真菌高效表达异源蛋白研究进展［J］.生物工程学报，2008，24(4):531-540.

［49］ Zhang J，Zhong Y，Zhao X，et al.Development of the cellulolytic fungus Trichoderma reesei strain with enhanced beta-glucosidase and f i lter paper activity using strong artif i cial cellobiohydrolase 1 promoter［J］.Bioresour Technol，2010，101(24):9815-9818.

［50］ Murray P，Aro N，Collins C，et al.Expression in Trichoderma reesei and characterisation of a thermostable family 3 betaglucosidase from the moderately thermophilic fungus Talaromyces emersonii［J］.Protein Expr Purif，2004，38(2):248-257.

［51］ Miettinen-Oinonen A，Paloheimo M，Lantto R，et al.Enhanced production ofcellobiohydrolasesin Trichoderma reeseiand evaluation of the new preparations in biofinishing of cotton［J］.J Biotechnol，2005，116(3):305-317.

［52］ Bower B，Larenas E，Mitchinson C.Exo-endo cellulase fusion protein:WO，20060057672［P］.2006-03-16.

［53］ AlperH，Moxley J，NevoigtE，etal.Engineering yeast transcription machineryforimproved ethanoltoleranceand production［J］.Science，2006，314:1565-1568.

［54］ Valkonen M，Ward M，Wang H，et al.Improvement of foreignprotein production in Aspergillus niger var.awamori by constitutive induction of the unfolded-protein response［J］.Appl Environ Microbiol，2003，69(12):6979-6986.

［55］ Idiris A，Tohda H，Kumagai H，et al.Engineering of protein secretion in yeast:strategies and impact on protein production［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2010，86:403-417.