昆虫漆酶的研究进展

于孟兰，倪金凤

(山东大学 生命科学学院 微生物国家重点实验室，济南 250100)

漆酶(laccase，EC 1.10.3.2)，是多铜氧化酶家族(multicopper oxidases，MCOs)中的最大组成部分，具有较广的底物范围，能够氧化双酚、氨基或甲氧基替代单酚、芳香二元胺、羟酚氨成分和木质素［1］。漆酶广泛存在于真菌、高等植物、细菌和昆虫中，在不同的物种中发挥着不同的作用。植物来源的漆酶主要参与木质素的生物合成与降解［2］。细菌漆酶［3］主要在黑色素产生、芽胞壁防御、形态发生和铜离子脱毒等方面起作用。真菌漆酶主要与色素生成、植物致病和木质素降解有关［4］;而昆虫漆酶主要参与木质素的氧化和昆虫角质层的鞣化。另外，漆酶在纺织、制浆、食品应用等方面都有广泛的用途［5］。

目前，关于木质素降解的研究主要集中于丝状担子菌(白腐菌和棕腐菌)。白腐菌通过氧化、脱甲基化等途径实现木头中木质素的降解［6］。而棕腐菌则能够绕过木质素屏障，通过对木质素进行微小的修饰来移除半纤维素和纤维素［7］。在复杂的生态环境(如昆虫肠道)中，微生物群体而非单个物种参与木质素降解，从而增加了研究难度。已有研究发现白蚁肠道微生物具有降解纤维素的能力［8］，但是木质素如何被降解还没有清晰地阐述［9］。Ni等［10］概述了木质素在白蚁肠道中的结构变化，Geib等［11］通过检测木质素在光肩星天牛(Anoplophora glabripennis)和溼木白蚁(Zootermopsis angusticollis)肠道内的化学变化，证实了昆虫肠道具有木质素的降解或修饰能力。

漆酶是重要的木质素降解酶之一。尽管昆虫角质层漆酶活性发现［12］已经超过50年，但是直到最近通过基因沉默的方法将昆虫角质层中的漆酶基因沉默，昆虫漆酶参与角质层鞣化、色素沉积等功能才真正被证实［13］。目前，基因组测序的广泛应用使得昆虫漆酶的寻找变得简单。研究人员发现一个昆虫中存在多种漆酶基因，说明不同的漆酶可能在昆虫生理上发挥不同的功能［14－15］。

本文中笔者主要对国内外昆虫漆酶的研究进行总结，展示昆虫漆酶的研究现状，挖掘昆虫漆酶的应用潜力。

1 昆虫漆酶的种类与分布

根据酶生理作用的不同，将昆虫漆酶主要分为漆酶1(laccase-1)和漆酶2(laccase-2)。漆酶1分布于昆虫的多种组织器官中，如唾液腺、中肠、马氏管等;而漆酶2主要分布于表皮、卵壳等组织中。其中，漆酶2已经被证明与角质层的鞣化有关［13］，对昆虫漆酶1的研究推测该酶主要参与食物的脱毒［15］。

2 昆虫漆酶的序列信息

与植物和真菌来源的漆酶相比，昆虫漆酶既有其相同之处也有其独特之处。相同之处表现为:①均含有1型(Type-1，T1)铜离子结合位点和2型/3型(Type-2/Type-3，T2/T3)位点构成的铜离子结合簇［16］。在这2个活性区域中，有10个保守的组氨酸和1个保守的半胱氨酸。②大多数漆酶是分泌型的，含有信号肽。③漆酶序列中含有多个糖基化位点。昆虫漆酶的独特之处为:①昆虫漆酶具有较长的N-末端序列。在漆酶第1个铜离子结合的组氨酸前面，真菌和植物来源的漆酶大约有60个氨基酸，而昆虫漆酶有大约200到400个氨基酸的残基。②昆虫漆酶N-末端相似性较低，差异较大。但在所有已知昆虫漆酶序列中，都含有一段特有的半胱氨酸-X-精氨酸-X-半胱氨酸(C-X-R-X-C)基序以及下游的多半胱氨酸序列，大约位于第1个铜离子结合组氨酸上游90个氨基酸的位置，而这段序列在植物和真菌漆酶中不存在［15］。③昆虫漆酶的T1铜离子中心含有一个保守的甲硫氨酸，而在真菌或植物漆酶中，这个保守的氨基酸大多为苯丙氨酸或者亮氨酸。由于这个氨基酸的不同，导致漆酶在T1区域的几何结构不同，从而使漆酶的氧化还原电位发生改变［17－18］。

漆酶工程数据库(laccase engineering database，LccED)是第1个多铜氧化酶的数据库，包含漆酶和多铜氧化酶的序列信息［16］。在 LccED(http:∥www.lcced.uni-stuttgart.de)中有11个超家族(超家族A～K)，包含56个亚家族。其中，昆虫漆酶属于超家族C，包括8个同源亚家族，排列为C1～C8。截至2013年5月28日，共有230个预测为漆酶或者多铜氧化酶的蛋白，包含275条序列，其中漆酶1的蛋白序列占11.7%，漆酶2占10%。目前，仍没有昆虫漆酶的晶体结构被解析出来。

3 昆虫漆酶的研究方法

分布于唾液腺、马氏管等组织的漆酶较易提取，直接解剖获得组织，研磨后离心，进行活性检测即可。而角质层中的漆酶因与角质层紧紧地结合在一起，使其性质研究受到很大的阻碍。早期研究使用的方法主要有:①酶解法，例如用胰蛋白酶或糜蛋白酶处理角质层，获得酶悬液。②化学提取法，如使用四硼酸钾和抗坏血酸的混合液或者尿素处理角质层将漆酶溶解出来［19］。但是，这2种方法有一些局限性，且不稳定。近年来，新发展起来的基因组、转录组、质谱分析等技术为昆虫漆酶基因的获得提供了方便，如对黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、家蚕(Bombyx mori)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)的基因组测序分析，发现了更多的漆酶基因。通过基因克隆的方法，可以对角质层漆酶的表达情况进行研究［15］。而 RNAi［20］技术则为研究昆虫漆酶参与角质层硬化等体内功能提供更直接的证据。

4 昆虫漆酶的体内功能

4.1 昆虫漆酶参与木质素的降解或食物脱毒

漆酶是真菌木质素降解中很重要的一个酶，对于昆虫漆酶的研究，多集中于漆酶2在昆虫外骨骼的硬化、表皮色素沉积和角质层鞣化方面的作用［21］，而对漆酶 1 的研究进展不大。Arakane 等［13］对赤拟谷盗(Tribolium castaneum)漆酶基因TcLac1进行沉默，但是没有观察到任何表型，以至于不能对TcLac1的功能得出结论。

对分布于烟草天蛾(Manduca sexta)马氏管和中肠中的漆酶MsLac1进行研究发现，当烟草天蛾进食后，漆酶基因MsLac1在马氏管和中肠组成型高表达，而在幼虫开始休眠时消失。因为马氏管和中肠在功能上与昆虫脱毒有关［22］，所以推测MsLac1可能与食物中的有毒成分氧化或脱毒有关［15］，或者参与离子代谢［23］。

Gorman等［14］研究发现冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)的多铜氧化酶AgMCO1也存在于马氏管和中肠。当对雌性冈比亚按蚊注射血液时，AgMCO1的表达量上调，说明AgMCO1可能参与离子代谢。但因雄性冈比亚按蚊、黑腹果蝇和烟草天蛾能够不依赖血液存活，说明AgMCO1的功能不仅仅是血液离子的脱毒。当注射细菌时，AgMCO1的基因转录与其在黑腹果蝇中的同源物一样，都出现明显地上调表达，表明AgMCO1可能参与昆虫体内的免疫调节。

黑尾叶蝉(Nephotettix cincticeps)的唾液腺在昆虫与水稻相互作用中发挥重要作用。黑尾叶蝉有2种漆酶1:NcLac1S和NcLac1G。NcLac1S只在唾液腺表达，而NcLac1G的表达在角质层、马氏管、中肠、唾液腺中都能检测到［24］。原位杂交实验证明，NcLac1S在唾液腺的V-cell中高度表达，这与之前的研究结果吻合。因此有学者认为，黑尾叶蝉唾液腺漆酶能够通过氧化作用，对水稻中的单酚进行脱毒作用，继而形成无毒的聚合物，并通过醌鞣化反应，使螫针鞘中出现的凝胶快速氧化［24－25］。

因白蚁能够有效利用难分解的木质纤维素，并将其转化为自身或者共生生物利用的能量，其在生物能源中的潜在应用受到广泛关注［9］。对低等白蚁黄肢散白蚁(Reticulitermes flavipes)肠道的宏转录组分析，在宿主文库中发现了6条漆酶转录组序列，而在共生生物的文库中没有发现，说明漆酶为宿主来源［26］。将这些序列与其他昆虫的漆酶进行序列比对，发现具有很高的同源性，也支持其为昆虫来源漆酶。以焦棓酸［1］为底物进行活性检测，证实黄肢散白蚁肠道漆酶具有氧化焦棓酸的能力［27］但不能氧化酪氨酸、多巴胺和其他黑色素前体，说明该酶没有昆虫角质层漆酶的功能。Coy等［26］将黄肢散白蚁的漆酶基因RfLac异源表达后进行活性分析，证明其具有木质素降解能力。

高等培菌白蚁的外部共生真菌，具有很高的漆酶活性，推测在培菌白蚁木质素降解中发挥重要的作用［28］。笔者所在课题组对培菌白蚁黄翅大白蚁中肠进行转录组测序，发现了预测为漆酶的转录组序列，与其他昆虫来源的漆酶序列进行系统进化树比较，证实为昆虫来源。该漆酶的功能尚不清楚。

4.2 昆虫漆酶参与角质层鞣化、硬化和色素化

昆虫外骨骼和/或角质层除了给昆虫提供保护作用外，还在昆虫的运动、呼吸和交流方面发挥重要的作用。角质层由表皮细胞分泌，并由上表皮和前表皮组成。在昆虫的角质层中，来源于多巴胺和二羟基苯乙醇的邻苯二酚被氧化生成醌，并与昆虫前表皮中的蛋白相交联，然后昆虫角质层实现鞣化［29］。邻苯二酚的氧化主要由存在于昆虫角质层中2种不同类型的酚氧化酶(酪氨酸酶和漆酶)催化完成。酪氨酸酶具有一元酚单氧酶(monophenol monooxygenase，EC 1.14.18.1)活性，可以将一元酚羟化产生 o-苯二酚，然后发挥儿茶酚氧化酶(catechol oxidase，o-diphenol oxidase，EC 1.10.3.1)的活性，将o-苯二酚氧化成相应的苯醌。漆酶虽然缺少酪氨酸酶的单加氧酶活性，却能氧化o-苯二酚和p-苯二酚。针对酪氨酸酶已经做了很多的研究，且已被证实能在鞣化、伤口愈合和昆虫免疫方面发挥很大的作用［30］，虽然关于漆酶在这方面的研究很少，但仍有很多证据表明漆酶在角质层骨化过程中发挥重要的作用［31］。

Yamazaki［32］在黑果蝇(D.virilils)的蛹壳中发现了一个与蛹壳硬化有关的酚氧化酶。酶活性分析发现，在蛹壳开始形成阶段，能够检测到酶活性，并在蛹壳形成后3 h达到最大酶活。通过对该酶的性质鉴定，确定为漆酶。在黑腹果蝇的蛹壳角质层中，也发现类似的酶。以甲基氢醌为底物对铜绿蝇(Lucilia cuprina)3龄幼虫角质层中溶解出来的酶进行活性分析，发现在蜕皮期酶的氧化活性与脱皮的相关性较好，活性在休眠早期很低，而在蛹化期则增加至之前的5倍［33］。

对家蚕中存在的漆酶进行纯化分析发现了BmLaccase2。该漆酶在蜕皮前的上皮中高度表达，但在新蜕皮蛹的角质层中却不能检测到该漆酶的活性，只能在蜕皮结束的几小时后检测到，表明该漆酶以无活性的酶原形式生成，然后在蜕皮后被激活［19］。

采用RANi技术将赤拟谷盗的漆酶2基因沉默，发现角质层不能硬化，同时伴有角质层不能染色和躯体残疾［34－35］，且导致个体在脱皮期死亡。而采用同样的方法敲除漆酶1或酚氧化酶酪氨酸酶对角质层的鞣化没有影响。对松墨天牛(Monochamus alternatus)漆酶2的敲除得出了与赤拟谷盗类似的结果。说明漆酶2在角质层鞣化、形态学和色素沉积等方面发挥重要的作用［36］。对冈比亚按蚊进行基因组分析［14］，对家蚕［19］和烟草天蛾［37］进行质谱分析，也鉴定出了漆酶2。

对半翅类昆虫椿象的3个属的点蜂缘蝽(Riptortus pedestris，Alydidae)、孔背长椿象(Nysius plebeius，Lygaeidae)和 臭蝽(Megacopta punctatissima，Plataspidae)的漆酶2进行研究，发现在蜕皮前，漆酶2基因在表皮组织高度表达，而当用RNAi技术将漆酶2基因沉默则使蜕皮后的色素沉积被阻碍，且这种阻碍具有剂量依赖性［21］。

4.3 昆虫漆酶的其他功能

对意蜂(Apis mellifera)的漆酶2(Amlac2)进行研究，表明Amlac2的表达受蜕皮激素调控，且对成年蜜蜂外骨骼的分化有重要的作用［38］。对白纹伊蚊(A.albopictus)的漆酶2研究发现，漆酶2对其蛋壳硬化和色素沉积发挥重要的作用。因雌性白纹伊蚊在吸食血液后，漆酶2基因上调，预测漆酶2与白纹伊蚊卵巢的发育有关［39］。

对淡色库蚊(Culex pipiens pallens)的漆酶2(CpLac2)的研究表明，CpLac2不仅在蛋壳的鞣化和角质层的硬化方面发挥作用，当分别对药敏感和不敏感的淡色库蚊中CpLac2的表达量进行分析时，发现对药不敏感的淡色库蚊过表达CpLac2。这说明，CpLac2可能会通过加固蛋壳的角质层，以降低农药的渗透率［40］。

在瘤姬蜂(Pimpla hypochondriaca)的毒囊中也存在漆酶PhLac1，且具有L-多巴胺氧化活性，说明该酶可能与鞣化途径有关。或者，该酶可能通过引起血细胞裂解或阻止拟寄生幼虫的包装以规避宿主的免疫系统［41］。

4.4 昆虫漆酶酶学性质分析

酶的底物特异性、米氏常数分析为掌握酶的功能提供了很高的参考价值。Dittmer等［42］通过对家蚕、红头丽蝇(Calliphora vicina)、黑腹果蝇、黑果蝇、铜绿蝇、烟草天蛾、黑尾叶蝉等漆酶酶活性分析发现，漆酶的最适pH呈酸性，并且具有很高的热稳定性，除了对内生底物乙酰多巴胺(N-acetyldopamine，NADA)和 丙 氨 酰 多 巴 胺 (N-β-alanyldopamine，NBAD)具有很高的活性外，还能分别在以甲基邻苯二酚 (4-methylcatechol，4-MC)和 甲 基 氢 醌(methylhydroquinone，MHQ)为底物的反应中观察到高活性。而对欧美散白蚁唾液腺及前肠的漆酶酶活性测定发现，该漆酶对2，6-DMP和焦棓酸具有很高的氧化能力，但不能氧化左旋多巴(L-DOPA)，也说明白蚁肠道的漆酶可能参与木质素氧化［26］。表1为目前已经进行酶学性质分析的昆虫漆酶及其对应的基因序列号的信息汇总。

表1 酶学性质分析的昆虫漆酶Table 1 Characterized insect laccases

漆酶酶活性分析数据中，测定米氏常数的数据较少，仅发现家蚕、红头丽蝇、烟草天蛾和鼠丽蝇来源的漆酶有相关的米氏常数测定数值。其中最大和最小的米氏常数均在烟草天蛾漆酶实验组，所对应的底物分别为二羟基苯丙氨酸(DOPA)和甲基氢醌［46］。Groman等［47］分别对赤拟谷盗和冈比亚按蚊漆酶2的4个亚型漆酶的米氏常数进行测定。结果表明，其中2个亚型A和B的底物特异性没有大的差异，并得出漆酶2的亚型可能在体内氧化相同的底物，而各亚型在功能上的差异还需要进一步的实验验证。

5 结论

漆酶在细菌、真菌、高等植物中都发挥着非常重要的作用，在昆虫中也不例外。近十年对昆虫漆酶功能研究证明漆酶2广泛参与昆虫角质层的鞣化，而漆酶1可能参与木质素的脱毒;同时，低等白蚁肠道内源性漆酶的发现为昆虫可能参与木质素的降解提供证据。角质层鞣化、硬化和色素沉积对昆虫的生长、发育、存活是必需的，应用漆酶2参与昆虫角质层鞣化这一特性，为研制生物杀虫剂提供了实验依据。虽然通过基因组、转录组等测序技术使得昆虫漆酶序列的发现变得更为容易，但还需要更多的实验证据对昆虫漆酶的重要性进行支持和验证，昆虫漆酶也有更多的潜力值得挖掘。

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