海娜花抗真菌有效成分的提取工艺优化与抑菌效力研究

(江苏省盐城市第一人民医院药剂科，江苏 盐城 224001)

海娜花，即指甲花 Lawsonia inermis L.，为千屈菜科 (Lythtaceae)散沫花属植物，我国汉代《南方草木状》中称其为散沫花，1964年版《维吾尔医常用药材》中称指甲花的维吾尔语名称为Hina或Mihid，还指出其英文名称为Henna。

1 仪器与试药

DF-2型集热式磁力加热搅拌器(上海亚荣生化仪器厂)；SHZ-CA型循环水式多用真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司)；RE-2000B型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；85-2A型恒温磁力搅拌器(常州博远实验分析仪器厂)，LC-20型高效液相色谱仪(日本岛津公司)。95%乙醇、甲醇(分析纯，西陇化工)，磷酸二氢铵，磷酸；海娜花粉(天然植物粉，乌鲁木齐印伊海娜有限公司)；马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA，生化试剂，广东环凯)，RPMI-1640液体培养基(生化试剂，赛默飞世尔)；白色念珠菌冻干粉(生化试剂，南京便诊生物科技，CMCC98001)；刃天青。

2 方法与结果

2.1 高效液相色谱(HPLC)条件

色谱柱:Agilent Zorbax SB-C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)；流动相:A为30 mmol/L磷酸二氢铵，B为甲醇(用磷酸调pH=3)溶液，梯度洗脱；柱温:30 ℃；进样量:20 μL。

2.2 海娜有效成分提取方法优化

2.2.1回流提取法

溶剂浓度选择:称量海娜花粉5 g，精密称定，置圆底烧瓶中，分别加入50%，70%，90%乙醇50 mL，于80℃温度下回流提取，每隔1 h取出液体，过滤，残渣继续加入50%，70%，90%乙醇50 mL回流提取，重复上述步骤3次。量取提取液10 mL，40℃减压蒸干，用2 mL HPLC法流动相复溶，过0.22 μm微孔滤膜后，采用HPLC法检测[1]。结果见表1。可见，90%乙醇回流提取时出峰晚，物质的非极性高；用50%乙醇回流提取时出峰早，物质的极性高；而70%乙醇介于两者之间。因此，选择70%乙醇作为优化的回流提取溶剂。

表1 3种不同浓度乙醇回流提取液的峰面积比较

提取温度选择:称量海娜花粉5g，精密称定，置圆底烧瓶中，加入70%乙醇50mL，分别在60，80，100℃温度下回流提取，每隔1h取出液体，过滤，残渣继续加入70%乙醇50mL，保持上述3个温度回流提取，重复上述步骤3次。量取提取液10mL，40℃减压蒸干，用2mL HPLC法流动相复溶，过0.22μm微孔滤膜后，采用HPLC法检测。结果见表2。可见，100℃时的峰面积比60℃和80℃都要高，故此选择100℃作为优化的回流提取温度。

表2 不同温度下回流提取液的峰面积比较

提取时间选择:称量海娜花粉5 g，精密称定，置圆底烧瓶中，加入70%乙醇50 mL，100℃下分别回流0.5，1.0，1.5h，取出液体，过滤。量取提取液10mL，40℃减压蒸干。用2mL HPLC法流动相复溶，过0.22μm微孔滤膜后，采用HPLC法检测。结果见表3。可见，回流提取1.0h的峰面积比0.5h和1.5h的都要大，故提取时间选择1.0h。

表3 不同提取时间回流提取液的峰面积比较

2.2.2超声提取法

提取温度选择:称量海娜花粉5 g，精密称定，置圆底烧瓶中，加入70%乙醇50 mL，分别在40，50，60℃温度下超声提取，每隔1 h取出液体，过滤，残渣继续加入70%乙醇50 mL，保持上述3个温度超声提取，重复上述步骤3次。量取提取液10 mL，40℃减压蒸干，用2 mL HPLC法流动相复溶，过0.22 μm微孔滤膜后，采用HPLC法检测。结果见表4。可见，50℃温度下超声提取的峰面积较高，故选用50℃作为超声提取温度。

表4 不同温度下超声提取液的峰面积比较

提取时间选择:称量海娜花粉5 g，精密称定，置圆底烧瓶中，加入70%乙醇50 mL，在50℃下超声提取0.5，1.0，1.5 h，取出液体，过滤。量取提取液10 mL，40℃减压蒸干，用2 mL HPLC法流动相复溶，过0.22 μm微孔滤膜后，采用HPLC法检测。结果见表5。可见，超声提取1.5 h的峰面积比0.5 h和1.0 h的都要高，故超声提取时间选择1.5 h。

表5 不同提取时间超声提取液的峰面积比较

2.2.3相同条件下超声提取法与回流提取法比较

称量海娜花粉5 g，精密称定，置圆底烧瓶中，加入70%乙醇50mL，在60℃下分别回流提取和超声提取，每隔1h取出液体，过滤，残渣继续加入70%的乙醇50 mL回流或超声提取，重复上述步骤3次。量取提取液10mL，40℃减压蒸干，用2 mL HPLC法流动相复溶，过0.22μm微孔滤膜后，采用HPLC法检测。结果见表6。可见，在相同温度和时间下，回流提取法的峰面积明显大于超声提取法，故相同条件下回流提取法的效果更佳。

表6 2种提取方法的峰面积比较

2.3 体外抑菌试验

白色念珠菌的培养:将白色念珠菌冻干粉活化后，挑取少许菌落转种于PDA平板，28℃培养12d，用适量无菌生理盐水冲洗平板，用无菌移液管尖端轻轻探划白色念珠菌菌落，制备悬液。将含有分生孢子或孢囊孢子及菌丝片段的混悬液用无菌移液管移至无菌试管中，充分混匀静置5 min，将上部均一悬液转移到带螺纹的无菌管中，旋紧盖子，置旋涡混合器混匀15s。在分光光度计上读取分生孢子或孢囊孢子悬液吸光度(A)，调整 A为0.15。制备的菌悬液用RPMI-1640培养基1∶50稀释后，作为待接种物。

海娜花提取物稀释液的制备:称量海娜花粉5g，精密称定，置圆底烧瓶中，加入70%乙醇50mL，在100℃温度下回流提取，每隔1 h取出液体过滤，残渣继续加入70%乙醇50mL回流提取，重复上述步骤3次。合并3次的提取液，40℃减压蒸干，精密称取干浸膏适量，用RPMI-1640培养基配置成1 280μg/mL的贮备液。

接种:按照NCCLS M38-A方法[2]，将提取物稀释液在无菌96孔板的第2列到第11列孔之间进行倍比稀释，第1列孔装RPMI-1640培养基200 μL，作为无菌对照，第2列到第11列孔装倍比稀释过的海娜花提取物稀释液100 μL与菌悬液100 μL，第12列孔装无菌生理盐水100 μL与菌悬液100 μL，作为生长对照。各孔用枪头吹打均匀，每个浓度设3个重复。

结果判定:将96孔板在28℃培养箱静置孵育3 d，向各孔中加入比色指示剂刃天青，继续孵育30 min后，观察加样孔的颜色。蓝色表示无菌生长，紫色表示部分生长，红色表示生长，最低抑菌浓度(MIC)值为颜色由蓝色到紫色轻微改变时的最低药物质量浓度。试验结果显示，海娜花提取物对白色念珠菌的 MIC为320 ～640 μg/mL。

3 讨论

20世纪70年代，Abd-E-l Malik等[3]采用薄层色谱法对指甲花叶乙醇提取物中具有抗菌活性的4种成分进行了分离，其中3种分别被鉴定为没食子酸(gallic acid)、指甲花醌(lawsone，2-羟基-1，4-萘醌)和1，4-萘醌，并发现叶子提取物对葡萄球菌(Staphylococcus)、链球菌(Streptoccus)、布鲁氏菌(Brucella)、沙门菌(Salmonella)有抵抗作用，但对绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)和白色念珠菌(Candida albican)却没有抑制作用。20世纪80年代，Afzal等[4]对从指甲花叶中提取的1，2-二羟基-4-葡糖氧基萘醌的抗菌活性进行了研究，发现1，2-二羟基-4-葡糖氧基萘醌对枯草杆菌、酵母菌属(Paslorianas)有抑制作用。另外，Malekzadeh等[5]的研究表明，指甲花的提取物在生物体外对多种革兰阳性菌和革兰阴性菌均有抑制作用，且指甲花提取物的抗菌活性与其所含的主要染色物质指甲花醌有关。Awadh等[6]的研究也表明，指甲花的提取物(水、乙醇、乙酸乙酯提取物)具有抗菌活性，但未发现它有细胞毒活性。

溶剂浓度选择时，乙醇浓度为70%时的提取效果最佳，而浓度较低或较高时的提取效率会明显下降。可能是因为溶剂浓度较低时，海娜花中的有效成分不能被完全提取出来；而溶剂浓度较高时，虽然有效成分能被完全提取出来，但其中部分成分可能已被破坏，从而导致提取效率降低。

回流提取时，温度在100℃时的提取效果最佳，可能是由于温度高时分子运动加快，溶解速度变快，从而提取率增加。超声提取时，温度在50℃时的提取率最高，可能是因为温度太低有效成分不能被完全溶出，而温度过高时虽然溶出率增加，但超声和升温同时会将部分有效成分分解，导致提取率降低。

回流提取时提取时间为1 h的效果最佳，时间过短提取不充分，而时间过长又会破坏有效成分。超声提取时提取时间为1.5 h时的效果最佳，超声温度较低，即使提取时间达到1 h后有效成分仍不能被完全溶出，因而提取时间要比回流提取时长。

比较2种方法，在相同条件下，回流提取法的提取效率更高，可能是因为超声提取时分子间的运动过于剧烈而致使有效成分被破坏，使提取率降低。回流提取法的最佳工艺条件为:称量海娜花粉5g，精密称定，置圆底烧瓶中，加入70%乙醇50mL，在100℃下回流提取1 h，取出液体，过滤，残渣继续加入70%乙醇50 mL回流，重复提取3次。超声提取法的最佳工艺条件为:称量海娜花粉5 g，精密称定，置圆底烧瓶中，加入70%乙醇50 mL，在50℃下超声提取1.5 h，取出液体，过滤，残渣继续加入70%乙醇50 mL超声，重复提取3次。

海娜花提取物对白色念珠菌的 MIC为320～640 μg/mL，远高于一般抗真菌药物的 MIC值。这可能有两方面原因:一是天然药物提取物中的杂质和无效成分较多，真正抗真菌的有效成分含量较低；二是笔者对于NCCLS M38-A方法还不能熟练掌握，可能产生了操作误差[7-8]。因此，需要对海娜花提取物作进一步分离、纯化，得到抗真菌成分较高的产物；同时，应更好地掌握NCCLS M38-A方法，提高测定的准确度。

参考文献：

[1]陆国斌.高效液相色谱法在药物分析中的运用[J].中国药业，1998，7(2):19-21.

[2]李厚敏，刘 伟，李若瑜.美国临床实验室标准化委员会2003年版产孢丝状真菌药敏试验方案简介[J].中华检验医学杂志，2005，28(1):121-123.

[3]Abd-El-Malik Y.El-Leithy MA，Reda FA，et al，Antimcirobial principles in leaves of Lawsonia inermis[J].Zbl Bakt AbtⅡ，1973，128(1):61-67.

[4]Afzal M，Al-Oriquat G，Al-Hassan JM，et al.Isolation of 1，2-dihydroxynaphthalene from Lausonia inermis[J].Heterocycles，1984，22(4):813-816.

[5]Malekzadeh F，Shabestari PP.Therapeutic effects and in vitro activity of an extract from Lausonia inermis[J].J Sci Islamic Repub Iran，1989，1(1):7-12.

[6]Awadh Ali NA，Julich WD，Kusnick C，et al.Screening of Yemeni medicinal plants for antibacterial and cytotoxic activities[J].Journal of Ethnopharmacoligy，2001，74(2):173-179.

[7]刁有江，邓旭明.皮肤癣菌微量液基稀释法抗真菌先导化合物敏感性试验方法的建立[J].中国农学通报，2008，24(5):1-7.

[8]孙长贵，曾贤铭，杨 燕.丝状真菌常规药物敏感试验及其质量控制[J].临床检验杂志，2006，24(5):382-384.