喹诺酮类药物的作用机制耐药机制及研究进展*

刘杨，欧宁

南京医科大学第一附属医院药物研究室，南京 210029

喹诺酮类药物的作用机制耐药机制及研究进展*

刘杨，欧宁**

南京医科大学第一附属医院药物研究室，南京 210029

喹诺酮类药物主要作用于DNA拓扑异构酶，阻碍DNA复制，发挥广谱抗菌作用。但该类药物的耐药问题日益严重，耐药菌株频现。本文综述喹诺酮类药物的耐药机制及其研究进展。

喹诺酮类药物；耐药机制；细菌耐药性

喹诺酮类药物抗菌谱广，研发和应用发展迅速。第一代萘啶酸类主要作用于革兰阴性菌，第二代、第三代对革兰阳性菌也有较强作用，目前抗菌谱更广的第四代药物也相继问世。其中环丙沙星、司帕沙星、加替沙星、莫西沙星等还被作为二线抗结核病药物。但随着该类药物的广泛应用，其耐药性也日益严重[1]。本文就喹诺酮类药物的作用机制、耐药性机制的研究进展做一综述。

1 喹诺酮类药物的作用机制

1.1 影响喹诺酮类药物浓度的因素

喹诺酮类药物在细菌内的浓度主要受以下几个方式的影响：外膜的孔蛋白可以将药物被动扩散进入细菌内；细胞质膜上的被动扩散作用；通过磷脂进入壁膜空间；外排泵以及孔蛋白均可以排出细胞内的药物[2]。

1.2 喹诺酮类药物的抗菌机制及抗菌活性

快速杀菌是喹诺酮类药物的一大优点。喹诺酮类药物进入细胞内后，直接作用于DNA促旋酶（拓扑异构酶Ⅱ）和拓扑异构酶Ⅳ，二者分别是药物与革兰阴性菌和革兰阳性菌的主要靶点[3]。研究表明，喹诺酮类药物可形成喹诺酮-拓扑异构酶-DNA复合物，使酶结构发生改变而失活，达到抑菌效果；此外药物与DNA双链中非配对碱基结合，DNA促旋酶的A单位受到抑制，产生DNA缺口，引发DNA断裂，最终导致细菌死亡[2-3]。

喹诺酮类药物具有靶点特异性，例如，氧氟沙星与环丙沙星对DNA促旋酶的作用明显比依诺沙星小；贝西沙星对金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌内主要的DNA促旋酶和拓扑异构酶Ⅳ靶点兼有较强和相对平衡的活性[4]。5种喹诺酮类药物对肺炎链球菌靶酶的抑制活性见表1。

表1 5种喹诺酮类药物对肺炎链球菌靶酶的抑制活性IC50（mg·L-1）

喹诺酮类药物对不同菌种的抗菌强度差异较大，其最小抑菌浓度（MIC90），见表2。

2 细菌对喹诺酮类药物耐药的机制

喹诺酮类耐药菌株频繁出现，以大肠埃希菌、肺炎链球菌、葡萄球菌、淋病奈瑟球菌和伤寒沙门菌耐药性增高最显著，同时一些新的耐药菌株也陆续出现，例如耐甲氧西林金葡菌（MRSA）、耐万古霉素肠球菌（VRE）、耐青霉素肺炎链球菌（PRSP）等。

喹诺酮类药物耐药机制与抗菌靶点突变有关，细菌染色体上，喹诺酮类耐药决定区（quinolone resistant determining region，QRDR）的基因突变，是产生耐药性的主要原因。除此之外，耐药性质粒、细菌细胞膜通透性改变、主动外排机制、细菌生物被膜的形成也均是产生耐药性因素。

2.1 作用靶点及编码基因的改变

细菌对喹诺酮类耐药的靶点改变是由细菌染色体编码的DNA促旋酶和拓扑异构酶Ⅳ的基因突变而引起。DNA促旋酶的2个A亚基和2个B亚基分别由gyrA（gyrase subunit A）和gyrB（gyrase subunit B）基因编码[5]。拓扑异构酶Ⅳ（topoisomeraseⅣ）的2个C亚基和2个E亚基则分别由parC和parE基因编码[6]。这4种基因中的任意一种突变，都会使得喹诺酮类药物与酶结合能力降低，从而产生耐药性。在革兰阴性菌中，gyrA的突变较gyrB多；而引起革兰阳性菌耐药的靶点中，parC的突变较parE普遍[7]。例如，在肺炎克雷伯菌中，gyrA和parC均发生突变：gyrA的Ser83→Ile/Leu/Phe，Asp87→Ala/Glu，parC的Ser80→Ile等突变，均造成耐药[8]。在结核分枝杆菌中，耐药性主要由gyrA基因发生突变而引起，GCG90→GTC或GAG，TCG91→TTG，GAC94→GCC、AAC、TAC或GGC，而且91位和94位会联合突变[9]。耐喹诺酮类耐药的基因突变多发生在QRDR中gyrA的55、80、83、84、87、88、90、91、94位，parC的48、80、84、89、94位。空肠弯曲菌[10]、沙门菌[11]等都是通过该机制产生耐药。

表2 喹诺酮类药物对不同菌种的MIC90范围（mg·L-1）

2.2 质粒介导的耐药性

质粒介导的喹诺酮类耐药（plasmid-mediated quinolone resistance，PMQR）基因于1998年在肺炎克雷伯菌中被首次发现，命名为qnr（quinolone resistance protein），现已发现5种qnr基因，qnrA、qnrB、qnrS、qnrC、qnrD[12]。qnr蛋白是由质粒介导的qnr基因编码而成，通过与DNA促旋酶以及拓扑异构酶Ⅳ结合，降低了作为喹诺酮药物抑制作用分子靶位的拓扑异构酶-DNA复合体的数量，继而减弱了喹诺酮类药物对细菌DNA复制过程的抑制作用，导致细菌对喹诺酮类药物的敏感性降低，甚至会产生耐药菌株。据推测，qnr基因来自于自然界中一种微生物的染色体上，某些常见的qnr基因存在于水源微生物的染色体中，细菌可能会在淡水中获得这些基因[13]。qnr所引起的细菌对喹诺酮类药物敏感性的变化具有重要的临床意义。在临床抗感染治疗和动物实验中，喹诺酮药物敏感性降低后引起的细菌感染会导致治疗时间延长，甚至治疗失败，并对患者的健康造成严重的威胁[14]。

质粒还可由一种新的外排泵QepA（quinolone efflux pumb）产生耐药，包含qepA的质粒可介导细菌对亲水性喹诺酮药物（如环丙沙星和诺氟沙星）的耐药水平升高10倍，而对疏水性药物的MIC并没有很大差别[15]。还有一种较为罕见质粒介导的外排泵：OqxAB，仅在肺炎克雷伯菌的染色体上发现过[16]。

2006年，Robicsek等发现了一种新型氨基糖苷乙酰转移酶基因aac（6’）-Ib-cr（aminoglycoside 6’-N-acetyltransferase type Ib-cr）[17]。其编码的酶可以使喹诺酮类药物哌嗪环上的氨基氮乙酰化。因环丙沙星和诺氟沙星的哌嗪环上都有氨基，所以能被该酶灭活，而对萘啶酸、左旋氧氟沙星、莫西沙星无效。

2.3 细菌细胞膜通透性改变

喹诺酮类药物需要借助细菌的外膜蛋白和脂多糖才能进入到细菌内，发挥杀菌作用，而蛋白和脂多糖的变异在革兰阴性菌中广泛存在[18]。OmpF（outer membrane protein）和OmpC这两种孔蛋白主要存在于革兰阴性菌的外膜上，膜孔蛋白在发生改变后，药物在细菌内的积累就会减少，耐药性也会增加。现已发现多种能造成革兰阴性菌细胞膜通透性下降的突变基因，这些基因没有直接的表达产物，不能调控其它的邻近基因，但都能造成OmpF的减少，这样也会使得四环素、氯霉素等小分子亲水性药物难以进入细菌内，发生交叉耐药。

2.4 药物主动外排机制

主动外排机制是近年来关注较多的一种机制。在细菌的细胞膜上存在着一类蛋白外排泵，可以借助质子驱动力（H+）将药物排出细胞外，产生耐药，这种排出可以是选择性的，也可以是非选择性的。这种质子依赖型主动外排泵主要是acrAB-tolC系统，由质子转运子acrB（acriflavin resistance protein B）、周质融合蛋白acrA和外膜通道蛋白tolC（type I secretion outer membrane protein）组成。当异物进入细胞内后，内膜上的acrB可以将其捕获，待底物与转运子相结合后，tolC与acrAB复合体结合并打开其内在通道，将异物排出细胞外[19]。通过该机制耐药的有大肠杆菌和铜绿假单胞菌等。

在过去的10余年中，外排机制在革兰阴性菌的多重耐药性中起着重要作用。近年来，在acrAB-tolC外排系统中，提出了acrB外排泵与药物底物进行有序结合，使acrB蛋白的3个原聚体分别经历药物“进入”、“结合”及“泵出”的结构变化，形成了功能复杂的三步骤旋转外排机制或蠕动泵机制。

2.5 细菌生物被膜的形成

细菌生物被膜是指细菌粘附于接触物表面，分泌多糖基质、纤维蛋白、脂质蛋白等，将其自身包绕其中而形成的大量细菌聚集膜样物。多糖基质通常是指多糖蛋白复合物，也包括由周边沉淀的有机物和无机物等。细菌生物被膜会粘附在各种医疗器械及导管上极难清除，随着医疗技术的迅猛发展，导管、插管等植入性和介入性的材料在临床上应用广泛，随之产生的生物材料感染也逐年增加[20]。

其耐药机制主要有以下三个解释：①抗生素渗透屏障学说：胞外多糖可形成密度高、空间狭小的胞外基质，大量的胞外基质以及菌株之间的狭小空间可以阻碍抗生素穿透生物被膜。②营养限制学说：当被膜内营养物质减少、氧气消耗增加、被膜菌生长速度减慢时，细菌会进入一种饥饿状态，这时候细菌对抗生素几乎不敏感。③被膜菌独特的表型结构学说：酰化高丝氨酸内酯（acyl-homoserine lactone，AHL）是生物被膜内细胞间主要的信号传递分子，在体外试验中发现，细菌群体感应系统正常的细菌可以产生有效抗菌的生物被膜；而群体感应系统有缺失的细菌，则不能产生完整的生物被膜，如果在群体感应系统缺陷的细菌中加入AHL，则细菌就又恢复了产生完整生物被膜的能力。如果在群体感应系统健全的细菌中加入群体感应拮抗剂，则形成结构稀疏的不完整的生物被膜[21]。

3 改善喹诺酮类药物耐药性的措施

3.1 安全合理用药

喹诺酮类药物在治疗中会产生消化系统、神经系统、皮肤反应、局部刺激、肝肾毒性、心脏毒性等不良反应。应严格掌握该类药物的适应症及剂量，以防滥用。联合用药可以增强疗效、降低不良反应等，但必须选用有协同或增强疗效的药物，及时调整用药方案。一般来说，喹诺酮类药物不宜与非甾体抗炎药、万古霉素、茶碱、氨基糖苷类等药物合用。采用分子生物学手段对临床菌株进行监控，防止耐药性传播，降低高耐受型细菌出现的概率。长期使用该类药物应加强对肝肾功能的检查[22]。

3.2 寻找新型、优良的喹诺酮类药物

对其侧链进行修饰，既能降低细胞毒性、肝毒性等副反应，又能增强对耐药菌的活性，例如对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌活性很好的TG-873870[23]。开发喹诺酮-杂合、轭合物也可以有效改善其耐药性问题，这是其未来发展的一个很好的方向。

4 结语

喹诺酮类药物出现仅30年，但细菌耐药形势已相当严峻，而且其耐药机制又是一个多因素、多机制的长期过程，所以在临床工作中要结合药敏实验，加强喹诺酮类药物使用的规范化，对质粒介导的耐药机制进行适时监测。在新型喹诺酮类药物的研发上，要在早期的工作中预测到如何降低细胞毒性、肝肾毒性、心脏毒性这些潜在的问题，对合成方法要合理简化、降低药物成本。我们相信随着对耐药问题越来越重视，在不久的未来喹诺酮类药物的耐药现状会得到很大的改善。

[1] Bearden DT,Danziger LH.Mechanism of action of and resistance to quinolones[J].Pharmacotherapy,2001,21 (10Pt2):S224-32．

[2] Piddock LJ.Mechanism of quinolone uptake into bacterial cells[J].Antimicrob Chemother,1991,27(4):399-403．

[3] Drlica K,Malik M,Kerns R J,et al.Quinolone-mediated bacterial death[J].Antimicrob Agents Chemother,2008,52(2):385-92.

[4] Cambau E,Matrat S,Pan XS,et al.Target specificity of the new fluoroquinolone besifloxacin in Streptococcus pneumoniae,Staphylococcus aureusand Escherichia coli [J].Antimicrob Chemother,2009,63(3):443-50．

[5] Giraud E,Baucheron S,Cloeckaert A.Resistance to fluoroquinolonesinSalmonella:Emergingmechanisms and resistance prevention strategies[J].Microbes Infection,2006,8(7):1937-44.

[6] Bebear CM,Charrion A,Bove JM,et al.Cloning and nucleotidesequencesoftheofthetopisometaseⅣparC and pare genes of Mycoplasma hominis[J].Antimicrob Agents Chemother,1998,42(8):2024-31.

[7] 黄小玲，林渡娣，杨春燕，等．喹诺酮类药对常见病原菌耐药变迁与耐药机制初探[J].中国医药导报，2011，8（5）：128-30.

[8] 廖景光，李小燕，李敏妍，等.肺炎克雷伯杆菌对氟喹诺酮耐药的机制研究[J]．中国微生物学杂志，2012，24（2）：145-8．

[9] 杨辉，张国良，张明霞，等.结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药与gyrA基因突变的关系[J]．实用医学杂志，2012，28（20）：3457-9．

[10] Gibreel A,Sjogren E,Kaijser B,et al.Rapid emergenceofhigh-levelresistancetoquinolonesin Campylobacterjejuniassociatedwithmutational changesingyrAandparC[J].AntimicrobAgents Chemother,1998,42(12):3276-8.

[11] Kim KY,Park JH,Kwak HS,et al.Characterization of the quinolone resistance mechanism in foodborne Salmonella isolates with high nalidixic acid resistance [J].Int J Food Microbiol,2011,146(1):52-6.

[12] Wang M,Guo Q,Xu X,et al.New plasmid-mediated quinolone resistance gene,qnrC,found in a clinical isolateofProteusmirabilis[J].AntimicrobAgents Chemother,2009,53(5):1892-7.

[13] Tamang MD,Seol SY,Oh JY,et al.Plasmid-mediated quinolone resistance determinantsqnrA,qnrBandqnrSamongclinicalisolatesofEnterobacteriaceae in a Korean hospital[J].Antimicrob Agents Chemother, 2008,52(11):4159-62．

[14] Allou N,Cambau E,Massias L,et al.Impact of lowlevel resistance to fluoroquinolones due toqnrA1andqnrS1genes or agyrAmutation on ciprofloxaein bactericidal activity in a murine model ofEscherichia coliurinarytractinfection[J].AntimicrobAgents Chemother,2009,53(10):4292-7．

[15] Yamane K,Wachino J，Suzuki S，et al.New plasmidmediated fluoroquinolones efflux pumpQepA,found in an Escherichia coli clinical isolate[J].Antimicrob A-gents Chemother,2007,51(9):3354-60．

[16] Kim HB,Wang M,Park CH,et al．OqxAB encoding a multidrug efflux pump in human clinical isolates of Enterobacteriaceae[J].Antimicrob Agents Chemother, 2009,53(8):3582-4．

[17] Robicsek A,Strahilevitz J,Jacoby G A,et al.Fluoroquinolone-modifying enzyme:a new adaptation of a common aminoglycoside acetyltransferase[J].Nat Med, 2006,12(1):83-8.

[18] Danilchanka O,Pavlenok M,Niederweis M.Role of porinsforuptakeofantibioticsbyMycobacterium Smegmatis[J].Antimicrob Agents Chemother,2008,52 (9):3127-34.

[19] Dunham SA,Mcpherson CJ,Miller AA.The relative contribution of efflux and target gene mutations to fluoroquinolone resistance in recent clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa[J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis,2010,29(3):279-88.

[20] Ostrowska K,Strzelczyk A,Rozalski A,et al.Bacterialbiofilmasacauseofurinarytractinfectionpathogens,methods of prevention and eradication[J].Postepy Hig Med Dosw,2013,67(0):1027-33.

[21] Stewart PS,Costerton JW.Antibiotic resistance of bacteria in biofilms[J].Lancet,2001,358(9276):135-8.

[22] 李淑珍.合理使用氟喹诺酮类抗生素[J]．中国医药指南，2012，26：379-80．

[23] Chen YH,Liu CY,Lu JJ,et al.In vitroactivity of nemonoxacin(TG-873870),a novel non-fluorinated quinolone,against clinical isolates of Staphylococcus aureus,EnterococciandStreptococcuspneumoniaewith various resistance phenotypes in Taiwan[J].J Antimicrob Chemother,2009,64(6):1226-9.

Mechanism of Quinolone Resistance and Its Research Progress

LIU Yang,OU Ning*
Research Division of Pharmacology,the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University,Nanjing 210029,China

Quinolones are broad spectrum antibiotics for clinical infections,by binding on topoisomerases to prevent DNA replication.But the problems of drug resistance increase seriously in recent years.This article reviews the mechanism of quinolone resistance and its research progress.

Quinolones;Mechanisms of resistance;Bacterial resistance

R978.1+9

A

1673-7806（2014）02-140-04

呼吸病新药临床评价研究技术平台建设项目（2011ZX09302-003-02）；江苏省药物与医疗器械临床评价研究服务中心提升项目（BM2011017）

刘杨，男，硕士生 E-mail:liuyang_njmu@163.com

**通讯作者 欧宁，女，主任药师 E-mail:ouning2013@163.com

2013-12-20

2014-01-09