平菇中海藻糖的提取与含量测定

李仁茂　黄健华

摘要 [目的]对平菇中的海藻糖进行定性和定量分析。[方法]以平菇为试验材料，以热乙醇为抽提液，用纸层析进行定性分析，以蒽酮比色法进行定量测定。[结果]平菇（含水量为85%）中含有海藻糖，其含量为2.06%，干燥平菇中海藻糖含量则为13.7%。[结论]该研究可为海藻糖的提取和开发提供依据。

关键词 平菇；海藻糖；提取；含量；测定

中图分类号 S646.1+4 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）11-03369-03

Abstract [Objective] To make qualitative and quantitative analysis of trehalose in Pleurotus Ostreatus. [Method] The qualitative analysis was performed by paper chromatography， and the quantitative determination was conducted by anthrone spectrophotometry using Pleurotus Ostreatus as experiment material， hot alcohol as extracting reagent. [Results] The results showed that there is trehalose in Pleurotus Ostreatus which contain 85% water， in which the content of trehalose is 2.06%， while its content in dry Pleurotus Ostreatus is 13.7%. [Conclusion] This study will provide certain basis for extraction and development of trehalose.

Key words Pleurotus Ostreatus； Trehalose； Extraction； Content； Determination

海藻糖是蔗糖的同分异构体，基本性质同其他双糖，但海藻糖还有其他不同的功能。

①可以作为生物的碳源和能源。例如在原核生物中，海藻糖可以作为碳源；酵母和真菌中，存在于其孢子、果实体、空气菌丝和营养细胞，可作为碳源或能源。

②可以作为蛋白质和细胞膜的稳定剂和保护剂，保护它们不会脱水。有些生物如低湿生活的生物如植物、酵母细胞和真菌孢子可以在近乎脱水的情况下仍然可以生存。利用海藻糖使细胞能够抗干燥（或其他应激的情况）也许是一种古老的适应功能，因为古细菌在应激情况下发现它可以产生并积累海藻糖[3]。明白这些机制可以使科研人员发明保存易干燥生物材料的新方法。

海藻糖可以抑制细胞膜的相转变温度，该糖可以在缺乏水的情况下维持脂处于液态的晶体状态[4]。X射线衍射研究表明，海藻糖恰到好处地位于细胞膜极性头部之间的多个位点处，海藻糖的较强稳定效应与它的立体化学结构有关，这种结构保证了海藻糖能与极性基团的头部匹配[5]。海藻糖也可以在干燥情况下保护不稳定的蛋白质。它由于没有还原性不会发生褐变反应，而褐变反应会导致蛋白质的变性。

③防热。海藻糖在耐热方面有着关键的作用，在应激的情况下海藻糖合成酶会被诱导产生，增加海藻糖的含量。海藻糖在较高温度下可以通过稳定蛋白质使细胞免于热的损伤。此外，海藻糖还具有抑制已经变性蛋白质的聚集。在酵母和植物中，海藻糖可以作为信号分子指导和控制某种代谢途径甚至影响生长。此外，已经证明海藻糖可以保护蛋白质和细胞膜免于因很多应激条件所造成的失活和变性，这些应激包括干燥、脱水、热、寒冷和氧化等[1]。

④免于自由基的损伤。海藻糖可以保护细胞不受到氧自由基的损伤，还可以清除氧自由基[6]。⑤防寒。海藻糖在低温下可以阻止某种蛋白质的变性和聚集，稳定低温情况下流动性降低的细胞膜。可以观察到当细胞膜的两侧有海藻糖存在时，外源海藻糖可以最大程度地保护生物免于冻伤。

⑥作为感应化合物和生长调节剂。海藻糖或者相关代谢物可以作为植物生长和发育的调节物。这一作用类似于酵母中6磷酸海藻糖对己糖激酶和糖酵解的作用。

⑦作为细菌细胞壁的结构组分。在分枝杆菌和棒状杆菌中海藻糖是许多细胞壁脂类的基本组分[7]。

在动物界中，成年蛔虫和蛔虫卵含有大量海藻糖（占干重的6%～9%）[8]。至今为止还没有在高等脊椎动物中发现海藻糖，在人的肾和小肠只是发现了海藻糖酶[9-10]。

⑧其他功能。在大肠杆菌中海藻糖是高渗透压的产物[11]，在嗜盐微生物和蓝细菌中也可以作为一种结构组分或相应的溶质[8]。

由于海藻糖具有上述良好的功能和性质，使它在分子生物学、食品、医药、化妆品、农业等基础科学研究和应用领域得到了广泛应用。它具有良好的防腐储存作用，赋予生物体抵抗干燥、干旱、寒冷等恶劣环境的能力，为其在生物制品活性保存以及食品、化妆品方面的应用奠定了基础[12-13]。目前，获得海藻糖的主要材料是面包酵母，从其他生物体中提取海藻糖的研究报道较少。笔者以平菇为材料，对平菇中的海藻糖进行定性分析和定量分析，以期为海藻糖的提取、开发及应用提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 提取材料平菇[Pleurotus ostreatus（Jacq.ex Fx）kummer]从湛江当地的农贸市场上购得。

主要试剂：活性碳、732强酸性阳离子交换树脂、717强碱性阴离子交换树脂、海藻糖等，均为国产分析纯。标准海藻糖溶液：海藻糖的水溶液，浓度为10 mg/ml。海藻糖鉴定用试剂： A液，AgNO3的水-丙酮饱和溶液，水∶丙酮=1∶200（V/V）；B液，将1 g NaOH晶体溶于100 g乙醇水溶液中，乙醇∶水=1∶1（W/W）。 蒽酮试剂：100 mg蒽酮溶于100 ml 98%H2SO4，呈淡黄色。

1.2 方法

1.2.1 粗提[14]。

称取20 g平菇（含水量约为85%），将其在研钵中磨成匀浆，然后加40 ml 70% 乙醇，于80 ℃热水中抽提1.5 h，并且不时搅拌。3 000 r/ min离心10 min，取上清液，残渣用5 ml 70% 乙醇洗涤2次，合并上清液。

1.2.2 除杂质、脱色[15]。在上清液中加入30 ml 20%ZnSO4溶液，以饱和Ba（OH）2调节pH到8，再加入5 g活性炭，于70 ℃热水中加热10 min并不时搅拌，3 000 r/min 离心10 min，取上清液加热浓缩至10 ml。

1.2.3 平菇提取液中离子的去除[16]。 取50 ml 732强酸性阳离子交换树脂，预先处理成H+型，树脂均匀装填于1 cm×40 cm的层析柱中，将10 ml提取液全部转移到此离子交换树脂面上，以蒸馏水洗脱（流速不能太快，用恒流泵控制流速2.5 ml/min），用烧杯收集洗脱液，直至流出液无糖为止（以蒽酮试剂检查）。并用上法去除阴离子。量取洗脱液体积，取其1/10放在表面皿上，以沸水浴蒸发至干，所得干燥样品用1 ml蒸馏水溶解，此1 ml经离子交换树脂纯化的样品溶液相当于2 g平菇提取所得到的海藻糖液。

1.2.4 平菇提取液中糖的分离鉴定[17]。取7 cm×20 cm层析滤纸1张，用海藻糖标准溶液4 μl（浓度为10 mg/ml）点样，同时点取2个不同量的平菇提取液样点。以正丁醇∶丙酮∶水∶醋酸=10∶6∶6∶2（V/V）的混合液为展层液，将滤纸置于层析缸中，在室温下当样品上行到距原点15 cm的前沿上，取出，自然风干后，先在滤纸条上均匀地喷上A液，晾干后再均匀地喷上B液，并将滤纸条于暗处放置10 min，然后观察结果。

1.2.5 平菇提取液中海藻糖含量的测定[17-18]。

1.2.5.1 标准曲线的制作。取1张层析滤纸，距离滤纸末端5 cm画一起始线做7个点样用标记，左右两末端分别点10 mg/ml的标准海藻糖溶液3～4 μl作为参照点，其含海藻糖30～40 μg；中间5个标记上分别点上1.5、3.0、4.5、6.0、7.5 μl的标准海藻糖溶液作为测量点，使其分别含有15、30、45、60、75 μg的海藻糖，如上述方法一样展层。层析后对左右两端含有参照样品的滤纸进行显色，根据已经显色的斑点位置及大小剪下滤纸中间相应的未显色的测量点斑点，并在斑点附近剪同样大小的空白滤纸作为比色测定的对照。将滤纸片剪碎置于试管中，加10 ml 0.1 mol/L的盐酸洗脱20 h，然后取滤液2 ml加4 ml蒽酮试剂，沸水浴加热15 min，冷却后在波长620 nm处读取OD值。以海藻糖含量为横坐标，OD620为纵坐标，制作海藻糖测定标准曲线。

1.2.5.2 样品海藻糖含量的测定。

按适宜的点样量在滤纸上点上4点平菇提取液，滤纸左右2端各设1个点样点作为参照点，同“1.2.5.1”层析后对滤纸左右两侧含有参照点的样品染色，根据显色位置在滤纸上剪下未显色的斑点，同时剪下相同大小的空白滤纸做比色测定对照用。滤纸片剪碎后分别用10 ml 0.1 mol/L的盐酸抽提20 h，抽提液用蒽酮比色法测定海藻糖的含量。根据测定结果可计算出海藻糖的含量，换算出1 g平菇中所含海藻糖的含量。

1.2.6 海藻糖生物学性质的测定。

向编号为1～3的试管中分别加入4 ml的10%（W/V）的奶粉溶液，在编号1的试管中加入标准海藻糖溶液（浓度为100 mg/ml）2 ml，向2号试管中加入2 ml海藻糖提取液，3号试管作为对照，常温下放置3 d后计算总菌数。

2 结果与分析

2.1 海藻糖标准曲线

试验得海藻糖标准曲线见图2。由图2可知，其回归系数为0.997 8，线性良好，可以作测定海藻糖之用。

2.3 平菇中海藻糖含量 根据以上方法测定海藻糖的含量，测定的值经计算得到的结果见表1。

海藻糖含量可从标准曲线上查出，经过计算取其平均值，1 μl提取液中含有41.2 μg。按公式：

1 g平菇中海藻糖含量（%）=1 μl提取液中海藻糖含量×1 000/2×1 000 000×100%可算出平菇（含水量为85%）中海藻糖的含量为2.06%，则1 g干燥平菇中的海藻糖含量为13.7%。

2.4 海藻糖的生物活性 试验得出，1、2、3号试管的总菌数分别为2.2×107、2.8×107、7.1×107个/ml。由此可见，加标准海藻糖和加平菇提取液的奶粉溶液所含总菌数比空白对照的总菌数少，这说明提取液中含有与海藻糖相同的生物活性，也说明平菇中含有海藻糖。

3 讨论

纸层析法是一种古老的分析手段，具操作简单、费用低，操作易行等特点，至今仍被广泛采用，特别是在糖类分析中广泛应用。其Rf值重现性比薄层层析法好，更适合于海藻糖定性分析[19-20]，如果是定量分析其准确度和重现性差[21]。然而王兰等通过点样量、展层体系、洗脱体系的确定，解决了利用纸层析法定量测定海藻糖误差大、重现性差的问题[22]。因此，如果严格按照试验步骤操作的话，纸层析完全可以对海藻糖进行定量分析，并且其准确度和重现性都好[20]。虽然高效液相色谱法是海藻糖定量分析的首选方法，但不具备高效液相色谱时，纸层析法也可较好地用于海藻糖的定量分析。

由于展层体系是纸层析定量分析方法的关键。因此，笔者采用的展层剂系统为正丁醇∶丙酮∶水∶醋酸=10∶6∶6∶2（V/V）[22]，显色剂由A液（AgNO3的水-丙酮饱和液）和B液（NaOH的乙醇水溶液）组成，此展层体系能将海藻糖和葡萄糖以及其他还原糖分开。由此可看出，海藻糖在此展层溶液中的分离效果好，显色效果明显，棕黄色的底色显示出棕黑色的斑点。但是显色后的滤纸不能长期保存，是由于A液中的AgNO3见光氧化成黑色，从而使棕黄色的底色变成黑色，掩盖了显示效果。

该试验测得的海藻糖Rf值约为0.29，与刘传斌等[17]所测得的Rf值约为0.25有所不同。这可能是展层液的pH、展开方式、温度、滤纸等因素引起，其主要原因可能是滤纸的不

同造成的[20]。滤纸本身的pH及含水量对Rf值的影响很大，不同的滤纸得到不同的Rf值，不同的斑点形状。纸内含水量的多少随溶剂与纸对水的亲和力大小而异，质地不均一的滤纸常使溶剂扩展不一致，沿滤纸纤维的方向流动紊乱。纸的含水量不均一，不能得到理想的分离效果。除此之外，提取液中的杂质也会对Rf值有影响，造成Rf值与刘传斌等测定的不同。

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