犬细小病毒YBYJ株的分离鉴定及VP2基因的序列分析

张立媛 高旭 陈海迪 于清洋 方爽

摘要 [目的]为分离犬细小病毒（CPV）。[方法]采集疑似CPV感染病死犬的组织病料，用胎猫肾细胞（F81）进行病毒分离，并对分离的病毒进行回归动物试验、间接免疫荧光（IFA）及VP2基因PCR扩增鉴定。[结果]经盲传3代后F81出现明显细胞病变（CPE），分离病毒可导致2～3月龄犬出现典型犬细小病毒病（CP）的临床症状和特征性病理变化，通过IFA观察到特异性的绿色荧光，PCR扩增到VP2基因全长为1 755 bp，编码584个氨基酸。它与国内外具有代表性的18株CPV VP2基因的核苷酸同源性为98.0%～99.8%，氨基酸同源性为96.1%～99.8%。[结论]用F81细胞成功分离到1株强毒CPV，命名为YBYJ株。

关键词 犬细小病毒；VP2基因；分离鉴定；序列分析

中图分类号 S852.65+5 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）27-09370-03

Isolation and Identification of Canine Parvovirus YBYJ and the VP2 Gene Sequence Analysis

ZHANG Liyuan， GAO Xu*， CHEN Haidi et al

（Department of Veterinary Medicine， Agricultural College， Yanbian University， Yanj， Jilini 133000）

Abstract [Objective] The research aimed to isolate a strain of canine parvovirus （CPV） from samples of canine which might be infected by CPV， and make the identification and sequencing analysis of VP2 gene. [Method] The typical tissues of diseased canine were collected from an affected canine in Yanji City， isolated by F81 cell， and identified as canine parvovirus （CPV） by experiment animals infection， IFA， HA and PCR. [Result] The test results showed that the virus was neutralized by standard positive serum against CPV and had cell lesions clearly on blind pass three generations. The canine parvovirus VP2 gene of the isolate was 1 755 bp encoding a protein of 548 amino acids， which shared 98.0% to 99.8% identity of nucleotide and 96.1% to 99.8% identity of nucleotide amino acid sequences with domestic and overseas reference strains， respectively. [Conclusion] A virulent strain of CPV was successfully isolated and named as YBYJ.

Key words Canine parvovirus； VP2 gene； Isolation and identification； Sequence analysis

犬细小病毒病（Canine parvovirus infection，CP）是由犬细小病毒（Canine parvovirus，CPV）引起犬的一种急性接触性传染病^[1]，临床常表现高热稽留、剧烈呕吐、腹泻等症状，病犬以急性出血性胃肠炎或心肌炎为主要病理变化。该病具有发病急、死亡率高等特点，给养犬业带来了巨大的危害。1977年，Eugster和Naira在患出血性腹泻病的犬粪便中首次发现细小病毒粒子；1978年，Kelly等^[2]从患肠炎的病犬体内首次分离到CPV；1982年，梁士哲等^[3]首次报道我国存在CPV感染。此后，该病在世界各国家陆续发生，并将该病原体被命名为CPV2型，其与前期发现的犬微小病毒（Canine minute virus，CMV或CPV1型）在大小和形态上非常相似，但在宿主细胞嗜性和抗原性等方面存在显著差异。近年来，由于CPVVP2基因的变异，使CPV2型毒株发生抗原漂移，原始毒株逐渐被新抗原突变株（CPV2a、CPV2b、CPV2c）取代^[4-5]。这种频繁的抗原漂移导致异源疫苗难以预防地方株CPV感染。因此，分离到地方株CPV，用于疫苗研制是预防CP的有效手段。为此，笔者对延吉市疑似CPV感染病死犬进行病料收集和体外病毒分离，在对CPVVP2基因进行进化分析的基础上，对分离的病毒进行分型鉴定，旨在为后期的CPV疫苗研制和分子生物学研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 病料

采集自延边大学动物医院某疑似感染CPV死亡幼犬（2月龄）心、肝、脾、肺、肾、淋巴结、肠内容物等病料；CPV阳性血清由北京派克英生物技术有限公司惠赠。

1.2 细胞系及试验动物

胎猫肾细胞（F81）购自中国兽医药品监察所；2～3月龄健康犬购于延吉市某养殖场（经PCR与免疫胶体金试纸检测均为CPV阴性）。

1.3 主要试剂

胎牛血清、青链霉素混合液、EDTA胰蛋白酶消化液、兔抗犬FITCIgG荧光抗体，均购自索莱宝生物技术有限公司；RPMI1640，购自Thermo公司；pMD18T vector、限制性内切酶EcoR I和Xho I、Ex Taq DNA聚合酶、基因组DNA提取试剂盒，均购自TaKaRa公司；DNA胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒，购自Omega公司；DH5α感受态细胞，购自北京全式金生物技术有限公司。

1.4 病料处理及病毒分离

无菌采集疑似CPV感染犬心、肝、脾、肺、肾、淋巴结和肠内容物等病料，将病料与PBS按照1∶4的比例混合，研磨制成匀浆，经反复冻融3次后，4 500 r/min离心30 min，上清液用0.22 μm滤膜滤过除菌后，接种于贴壁培养的F81细胞，孵育1 h，弃上清攻毒液，加入细胞维持液于37 ℃、5% CO₂条件下培养，同时设立未接种病料研磨液的F81细胞空白对照组。在接种后3～5 d将培养物反复冻融3次，收集培养物，连续盲传继代培养，待F81细胞出现明显病变时收毒。

1.5 间接免疫荧光（IFA）鉴定

在24孔板上，将病毒接种F81细胞，37 ℃、5%CO₂条件培养72 h后，弃去培养液，用PBS洗3次，冷丙酮固定15 min，以CPV阳性血清为一抗，以兔抗犬FITCIgG为二抗，进行IFA检测。同时设置未接种病毒孔为阴性对照组。

1.6 病毒基因组提取与PCR鉴定

根据GenBank中已发表的CPVVP2基因序列（JN867607）保守区设计PCR扩增特异引物，上游引物（1U28）：5ATAATATAATTTTCTAGGTGCTAG3（Xho I），预期扩增片段大小为1 755 bp，引物由上海英骏生物技术有限公司合成。PCR扩增条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min； 52 ℃ 1 min ；72 ℃ 2 min，30次循环；72 ℃ 10 min。

1.7 病毒血凝（HA）试验及TCID50测定

收集第5代CPV病毒液，用1%猪红细胞进行HA试验，同时设立阴性对照组。将第5代CPV培养液10倍倍比稀释，取6个稀释梯度（10¹～10⁶）分别接种96孔F81悬液，每孔100 μl，37 ℃、5% CO₂条件培养72 h后观察细胞形态，并采用ReedMuench方法计算TCID50。

1.8 病毒回归试验

将8只2～3月龄健康犬随机分为2组。试验组5只，口服细胞病毒（CPV）稀释液，3 ml/只（104.5TCID50/只）；对照组3只，口服等量生理盐水。每天观察其临床症状，记录体温。对试验组发病犬剖检，观察其病理变化。

1.9 基因测序与进化分析

按照TaKaRa基因组提取试剂盒说明书提取CPV基因组，通过PCR扩增将PCR产物克隆于pMD18T载体，构建重组克隆质粒。将PCR和酶切鉴定均正确质粒送交上海英骏生物技术有限公司进行测序，并使用DNAStar软件对测序结果进行序列比对和进化分析。

2 结果与分析

2.1 病毒的分离与培养

将收集的疑似CPV感染病料10倍稀释接种F81细胞。连续传代，接种病毒3～5 d后可见心脏病料感染的F81细胞出现明显CPE，表现为细胞集聚、脱落、崩解和破碎，正常对照组F81细胞生长状态良好，其他组织病料接种的F81细胞未出现明显CPE（图1）。

2.3 病毒血凝试验（HA）及TCID50测定结果

经1%猪红细胞进行HA检测，第5代CPV的HA效价为1∶256。采用ReedMuench方法计算病毒滴度，第5代CPV的TCID50为2×10⁶/ ml。

2.4 病毒回归试验

以第5代CPV液感染2～3月健康犬，1周后试验组5只犬相继出现明显CP临床症状，表现为可视黏膜苍白、精神萎靡、呕吐、发热、腹泻、听诊心内有杂音明显等症状，相续发生死亡，至第10天全部死亡。对病死犬进行剖检发现，病理变化与自然感染死亡病例相似，可见心肌肿大、肠粘膜出血等病理特征，而空白对照组未见CP临床症状，未出现死亡。

2.5 VP2基因测序与序列分析

测序结果表明，YBYJ株CPVVP2基因全长1 755 bp，编码584个氨基酸，将YBYJ株

CPVVP2基因上传至GenBank（KM014812）。经序列分析，与GenBank中收录的国内外18株CPVVP2基因进行比对，CPVVP2核苷酸序列同源性为98.0%～99.8%，氨基酸序列同源性为96.1%～99.8%，将其命名为YBYJ株。CPVVP2编码的氨基酸进化树分析表明，YBYJ株VP2蛋白在氨基酸水平上与浙江（Zhejiang：EU213085）、陕西（Shanxi：JN403045）、哈尔滨（Harbin：JQ743906）、长春（Changchun：GU569936）分离株较近，而与印度（India：JN625224）、法国（France：DQ026002）、美国（USA：JN867607）分离株较远（图4）。

3 结论与讨论

吉林省延吉市地处延边朝鲜族自治州，基于民族饮食的

特色，肉用犬需求量极大，但犬类烈性传染病一直困扰着养犬业发展，由于犬类传染病在犬之间传播和流行迅速，短期内造成全群感染，而且制约了大规模、集约化肉用犬的养殖。在诸多危害犬类健康的传染性疾病中，以CPV感染最为常见，且危害较大，尤其在幼犬中传染性极强，死亡率极高^[6]。因此，采用有效疫苗进行免疫接种是保证养犬业健康发展的关键。

目前，世界范围流行的致病毒株多为CPV2型，病毒含3个结构基因，分别为VP1、VP2和VP3，其中VP2基因编码病毒衣壳蛋白，可以诱导机体产生中和抗体，VP2基因常发生突变，导致了病毒的抗原漂移，使原始CPV2型毒株逐渐被新的抗原突变株取代（CPV2a、CPV2b和CPV2c）^[7-9]，由于CPV2型毒株的快速突变，目前临床上使用的弱毒疫苗和灭活疫苗多数不具有针对性，而使免疫效果不够理想。因此，各地区亟需分离到地方性CPV株，用于疫苗的研制，有效预防当地CPV的传播和蔓延。笔者从延吉市疑似CPV感染病死犬采集病料，分离到YBYJ株CPV。在病毒分离过程中，尝试采用MDCK和F81细胞进行病毒分离，其中MDCK细胞分离组盲传数代未见明显CPE，经鉴定为分离病毒失败；采用F81细胞分离组，在盲传3代后发现心脏病料感染F81细胞出现明显CPE，其他病料感染组F81细胞CPE不明显，通过PCR、IFA和HA等试验鉴定，发现心脏病料感染组为CPV阳性，而其他病料组均为CPV阴性。结果表明，该试验中F81细胞更利于CPV的分离，对于心肌炎型CP采取心脏病料进行病毒分离是首选，这也与该病犬生前临床诊断为心肌炎型CP相符。通过回归动物试验发现，接种CPV的5只犬均发生死亡，证明该分离病毒为CPV强毒。

为VP2蛋白的第426位氨基酸为Asn（N）的CPV2型属于CPV2a亚型，这也得到了其他研究人员的一致认可^[7-9]。经序列比对发现，YBYJ株CPV的第426位氨基酸为Asn（N），所以将其界定为CPV2a亚型，属于我国目前流行病毒株（CPV2a、CPV2b和CPV2c）范畴。因此，笔者成功分离到1株CPV（YBYJ株），该病毒为CPV2a亚型，属于强毒，成功克隆CPVVP2基因，为下一步CPV疫苗研制和服务地方养犬业奠定了基础。

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