Plackett睟urman和Box睟enhnken Design设计优化促进红松多酚合成诱导条件的研究

刘冉 王振宇 尹红力 李婷婷

摘要 [目的]优化促进红松多酚合成的诱导条件。[方法]以红松不定芽为试验材料，通过单因素试验、PlackettBurman 设计试验和BoxBenhnken Design设计试验研究8种诱导子（苯丙氨酸、肉桂酸、茉莉酸甲酯、水杨酸、壳聚糖、酵母提取物、镧、铕）对红松不定芽中多酚合成的影响，并且对促进多酚合成的诱导子组合条件进行优化。[结果]除了肉桂酸外， 其他7种诱导子都能不同程度地提高多酚含量。PlackettBurman 试验确定了3种影响多酚合成的关键因素：壳聚糖、镧和茉莉酸甲酯。BoxBenhnken Design试验对3种关键因素（壳聚糖、镧、茉莉酸甲酯）协同作用的诱导条件进行优化，优化得到的最佳诱导条件为：壳聚糖浓度79.58 mg/L、镧浓度42.21 μmol/L、茉莉酸甲酯浓度16.63 μmol/L，预测多酚含量最高可达到14.28 mg/g，实际多酚含量为13.42 mg/g，与对照组相比提高了122.19%。[结论]PlackettBurman 设计结合BoxBenhnken Design响应面分析法可以很好地对促进多酚合成的诱导条件进行优化，3种诱导子（壳聚糖+镧+茉莉酸甲酯）协同组合比单一诱导子更有效地提高红松不定芽中多酚含量，更有利于地促进多酚的合成。

关键词 红松；多酚；诱导子；协同作用

中图分类号 S791.26；Q946.889 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）27-09269-05

Optimization of Induction Conditions of Promoting the Synthesis of Polyphenols from Pinus koraiensis by PlackettBurman and BoxBenhnken Design

LIU Ran¹， WANG Zhenyu1，2*， YIN Hongli¹et al

（1. College of Forestry， Northeast Forestry University， Harbin， Heilongjiang 150040； 2. School of Food Science and Engineering， Harbin Institute of Technology， Harbin， Heilongjiang 150090）

Abstract [Objective]The research aimed to optimize the induction condition of promoting the synthesis of polyphenols of Pinus koraiensis. [Method]The adventitious buds of Pinus koraiensis were used to study the effects of 8 inductors on the synthesis of polyphenols by singlefactor test， PlackettBurman design test and BoxBenhnken design test. 8 kinds of inductors were phenylalanine， cinnamic acid， methyl jasmonate， salicylic acid， chitosan， yeast extract， lanthanum and europium. The condition of promoting the synthesis of polyphenols inducers combination was optimized. [Result]Besides cinnamic acid， 7 kinds of inductors could improve the content of polyphenols in different degrees. 3 kinds of key factors which influenced the synthesis of polyphenols were established by PlackettBurman design test： chitosan，lanthanum and methyl jasmonate. The induciton conditions with 3 kinds of key factors were optimized by BoxBenhnken design test. The optimal induction condition was as follows： chitosan concentration 79.58 mg/L， lanthanum concentration 42.21 μmol/L and methyl jasmonate 16.63 μmol/L. The predicted value of the content of polyphenols was 14.28 mg/g and its experimental value was 13.42 mg/g. Compared with the control group， the content of polyphenols was increased by 122.19%. [Conclusion]The combination of PlackettBurman design and BoxBenhnken design response surface analysis could optimize the induction condition of promoting the synthesis of polyphenols well. The combination of 3 inductors （chitosan+lanthanum+methyl jasmonate） could more effectively improve the content of polyphenols， be more conducive to promote the synthesis of polyphenols than a single inductor in adventitious buds of Pinus koraiensis.

Key words Pinus koraiensis； Polyphenols； Inductor； Synergy

红松（Pinus koraiensis）是中国东北地区的优势树种，是一种药用裸子植物，具有极高的经济价值。多酚类物质是从植物中分离出来的一类次生代谢产物。由于其独特的化学结构，它具有显著的生理活性如抗氧化、螯合金属、调节酶的活性、调节细胞增殖等，有助于预防癌症和心脑血管疾病的发生^[1-2]。红松多酚可以作为一种天然、无毒、高效的抗氧化剂广泛应用于食品、保健品和医药领域，因此如何采取有效的措施提高红松多酚含量具有重要的意义。在植物次生代谢过程中，某些生物诱导子（如酵母提取物、真菌菌丝体和植物细胞壁片断等）或非生物诱导子（如植物激素、稀土元素、紫外线、重金属等）能作为一种特定的信号，诱导特定基因的表达，从而调节植物细胞次生代谢产物的合成^[3]。诱导子目前被广泛应用于植物细胞培养领域来提高天然产物的产量，有效地促进许多次生代谢产物如萜类、生物碱类、多酚类等物质的合成^[4-5]。添加诱导子已被证明是提高植物次生代谢产物的有效方法，而能否利用诱导子之间的相互作用来发掘更大的植物生产次生代谢产物的能力成为新的研究热点^[6]。笔者首先研究了8种诱导子（苯丙氨酸、肉桂酸、茉莉酸甲酯、水杨酸、壳聚糖、酵母提取物、镧、铕）对红松不定芽多酚中多酚含量的影响，初步筛选有利于多酚合成的诱导子种类和诱导浓度的参考范围。在此基础上，采用PlackettBurman 试验筛选影响多酚含量的关键因素，然后利用响应面分析法研究3种诱导子的协同作用对红松不定芽中多酚合成的影响。

1 材料与方法

1.1 试验材料

成熟的红松种子来源于小兴安岭地区的伊春红松林，采集后保存于-4 ℃的冰箱中。

1.2 红松幼苗的培养

将成熟红松种子灭菌后剥去胚乳，将完整胚作为外植体接种在DCR固体培养基上，25 ℃黑暗培养7 d，将此时诱导生成的红松不定芽作为各种诱导子处理的原材料。

1.3 诱导子处理

将苯丙氨酸、肉桂酸、茉莉酸甲酯、水杨酸、壳聚糖、酵母提取物、硝酸镧、氧化铕8种诱导子配制成溶液，过滤、灭菌后添加到DCR培养基，使得最终培养基中诱导子浓度达到设计的不同浓度梯度，以未添加诱导子作为对照。所有的处理设3次重复。每个培养瓶中接种6株红松不定芽，25 ℃黑暗培养8 d后收获，测定鲜重增长率和多酚含量。

1.4 红松不定芽鲜重增长率的测定

鲜重增长率=[（收获重量-初始重量）/初始重量]×100%

1.5 多酚提取和含量测定

多酚提取采用超声波提取法，收集培养8 d的新鲜红松不定芽约1.0 g进行液氮研磨，加入 20 ml浓度60%乙醇提取液，超声功率150 W、温度30 ℃提取2 h后，在5 000 r/min下离心10 min，定容到25 ml容量瓶中，即为多酚提取液。

取2 ml多酚提取液，用蒸馏水定容到10 ml容量瓶中，作为多酚含量测定样品。具体方法按照参考文献[7]的方法进行。没食子酸作为标准样品，其标准曲线为：

y=0.011 1x（R²= 0.999 2）

式中，x为没食子酸浓度，μg/ml。

1.6 PlackettBarman法筛选影响多酚合成的主要因素

选用试验次数N=7的PlackettBurman试验设计，考察了苯丙氨酸、镧、铕、水杨酸、酵母提取物、壳聚糖、茉莉酸甲酯7个因素，每个因素取2个水平，以多酚含量Y（mg/g）为响应值。每个因素取2个水平：低水平“-1”和高水平“+1”。采用minitab 15.0对数据进行回归分析。

1.7 响应面试验设计

根据PlackettBarman试验结果，利用Minitab15.0软件，根据BoxBenhnken的中心组合试验设计原理，设计壳聚糖浓度、镧浓度、茉莉酸甲酯浓度三因素三水平响应面分析试验，优化壳聚糖+镧+茉莉酸甲酯协同作用的诱导条件。

2 结果与分析

2.1 8种诱导子对红松多酚含量影响的单因素试验

2.1.1 前体物质对红松多酚合成的影响。

多酚作为一类重要的次生代谢产物，通过苯丙烷代谢途径合成。苯丙烷代谢途径上的第一步反应是L苯丙氨酸在PAL催化形成反式肉桂酸，是苯丙烷代谢途径上的第一个反应，因此苯丙氨酸和肉桂酸是松多酚合成重要的前体物质^[8]。

由图1可知，红松不定芽中多酚含量随苯丙氨酸浓度的提高呈现出先增加后降低的趋势。当苯丙氨酸的浓度达到2.00 mmol/L时，多酚含量达到最大值，为（9.47±0.47）mg/g，与对照组相比提高56.79%，说明2.00 mmol/L最有利于红松不定芽中多酚类物质的合成。高浓度的苯丙氨酸（600 mmol/L）处理红松不定芽，多酚含量低于对照组。这是由于高浓度的苯丙氨酸对红松不定芽细胞产生毒害作用，使得细胞活力降低，多酚合成的能力也降低。因此，苯丙氨酸的最佳添加浓度为2.00 mmol/L。

由图2可知，低浓度（0.05～0.20 mmol/L）的肉桂酸对红松不定芽多酚含量的影响与对照组相比无明显差异，而高浓度（0.50～2.00 mmol/L）的肉桂酸显著降低了多酚含量。结果表明，前体物质肉桂酸并不能促进红松不定芽中多酚的合成，反而对多酚的合成起抑制作用。

在植物细胞培养领域，前体物质饲喂是一种常见且有效地提高次生代谢产物合成的手段。郭丽梅等^[9]研究了前体物质对粉葛（Pueraria Lobata）细胞次生代谢的影响，发现低浓度的苯丙氨酸对总黄酮积累有较大的促进作用，而肉桂酸对粉葛细胞中黄酮含量的影响不明显。这与该试验结果基本一致。

2.3.3 回归模型的验证。

考虑到实际操作的可行性，将红松多酚合成的优化条件在回归方程得到的理论值基础上修正为壳聚糖浓度80 mg/L、镧浓度42 μmol/L、茉莉酸甲酯浓度17 μmol/L，在此条件下进行3组平行试验，多酚的平均含量为13.42 mg/g，相对误差为6.02%，略低于预测值。通过壳聚糖+镧+茉莉酸甲酯协同组合，与3种单一诱导子的诱导效果进行比较。由表4可知，壳聚糖+镧+茉莉酸甲酯协同作用更有利于红松不定芽中多酚含量的提高，对多酚合成的促进效果最佳。

3 结论

该研究选取8种诱导子，研究对红松不定芽中多酚合成的影响，其中苯丙氨酸和肉桂酸属于前体物质，茉莉酸甲酯和水杨酸属于植物激素，壳聚糖和酵母提取物属于生物诱导子，镧和铕属于稀土元素。单因素试验结果表明，除了肉桂酸不能提高红松不定芽中多酚含量以外，其他7种诱导子都能在不同程度提高多酚含量，促进多酚合成。PlackettBurman试验结果显示，7种诱导子因素影响多酚含量的显著性大小依次为壳聚糖>镧>茉莉酸甲酯>苯丙氨酸>铕>水杨酸>酵母提取物，确定影响多酚含量的3种关键因素为壳聚糖、镧、茉莉酸甲酯。通过对壳聚糖-镧-茉莉酸甲酯组合诱导条件进行BoxBenhnken Design响应面优化试验，优化得到的最佳诱导条件为壳聚糖浓度79.58 mg/L、镧浓度4221 μmol/L、茉莉酸甲酯浓度16.63 μmol/L，预测多酚含量最高可达14.28 mg/g，实际多酚含量为13.42 mg/g，与对照组相比提高122.19%。同时，3种诱导子（壳聚糖+镧+茉莉酸甲酯）协同组合比单一诱导子具有更佳的诱导多酚合成的效果。因此，利用诱导子之间的协同作用是一种有效的提高植物生产次生代谢产物合成能力的途径。

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