采用高效液相色谱法测定金银花中绿原酸含量方法探讨

管晓琴 孙 鹏 朱佳丽 祖若玉 曹冬梅

【摘 要】 目的 探讨采用高效液相色谱法测定金银花中绿原酸含量的方法，总结实验方法。方法 建立液相色谱条件：采用十八烷基硅烷键合硅胶（C18柱），流动相为乙腈：0.4%磷酸溶液（13∶87），检测波长在327nm，流动相流速为1ml/min。结果 绿原酸标准品在0.025mg/ml-0.2mg/ml范围内线性良好，线性系数r=0.9999，样品回收率达95.80%，精密度RSD=0.07%。结论 采用该方法能简单、快速、准确检测金银花中绿原酸含量，且结果可靠，重现性好，可以作为医疗上控制金银花量的依据。

【关键词】 高效液相色谱法；金银花；绿原酸；测定

【中图分类号】 R282.6 【文献标识码】 A

金银花用于医学界具有悠久的历史，是一种清热解毒、凉散风热的中药材，常用于治疗咽喉疼痛、嗓子干哑、风热感冒等症状。现代研究证明，金银花中发挥抗菌、抗病毒作用的主要是一种生物活性成分—绿原酸，因此，有效、准确的检测绿原酸含量成为判断金银花品质的关键[1]。本文研究了采用高效液相色谱法测定金银花中绿原酸含量的方法，为绿原酸的提取及检测积累了一定的经验，现记录如下：

1 材料与方法

1.1 材料 原料：金银花来自省药材站，放置于阴凉处，阴干至恒重，粉碎，过四号筛，作为样品备用；绿原酸标准品购于中国药品生物制品检定所，纯度达96.6%；乙腈为色谱纯、乙醇为分析纯。仪器：Agilent1200高效液相色谱，UV—2401PC光度计，电子天平，旋转蒸发仪。

1.2 方法

1.2.1 对照品与样品溶液制备 ①对照品溶液的制备：精密称取置五氧化二磷减压干燥器中干燥12小时的绿原酸对照品约20mg，置100ml棕色量瓶中，加50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置25ml棕色量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得40μg/ml的对照标准品溶液，（10℃以下保存）。②样品溶液的制备：取金银花，粉碎，过四号筛，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50ml，称定重量，超声处理（KQ-500B超声仪，功率250W，频率35kHz）30分钟，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，精密量取续滤液5ml，置25ml棕色量瓶中，加50%甲醇至刻度，摇匀，即得。

1.2.2 确定检测波长 取0.2ml备用溶液于25ml容量瓶中，甲醇定容，UV—2401PC光度计光谱扫描，选取最大吸收波长为高效液相检测波长，即327nm处。

1.2.3 色谱条件 色谱柱：C18柱（4.6mm150mm），流动相：乙腈：0.4%磷酸溶液（13∶87），流速：1ml/min，进样量：10μl，柱温：30℃，检测波长：327nm，保留时间7min，外标法测定。

1.2.4 标准曲线的绘制 精密称取绿原酸标准品10.00mg，50%甲醇溶液溶解，并定容至25ml容量瓶，得0.4mg/ml溶液，分別稀释成0.20mg/ml、0.15 mg/ml、0.10 mg/ml、0.05 mg/ml、0.025 mg/ml溶液。取各个浓度标准溶液10μl进样，每个浓度平行进3次，记录浓度下峰值。

1.2.5 提取液中绿原酸含量计算 根据样品液稀释程度，计算公式如下：

式中，X代表绿原酸含量，Ax代表样品中绿原酸峰面积，As代表标准溶液中绿原酸峰面积，Mx代表标准样品质量，Ms代表金银花质量。

2 结果与分析

2.1 光谱扫描 绿原酸在327nm处具有特征吸收峰，UV—2401PC光度计光谱在波长500-100nm范围内连续扫描提取液，发现提取液在327nm处有较强的吸收峰，因此我们确定提取液中含有绿原酸。

2.2 标准曲线 不同稀释浓度的标准溶液分别进样，HPLC检测，读取峰面积值，取三次的平均值，如表1所示。以峰面积为纵坐标，以绿原酸含量为横坐标作图，图1所示。

计算得回归方程为Y= 320062X - 552.76，相关系数R2=0.9999，表明该液相色谱条件下，绿原酸在0.025mg/ml-0.2mg/ml范围内具有良好的线性。

2.3 方法的回收率 称取不同质量的标准品，分别加入样品备用溶液，在上述同样色谱条件下检测其绿原酸含量。采用加标准品的样品测定结果减去未添加标准品的样品测定结果，计算标准品的回收率，结果如表2。方法的平均回收率为95.80%。

2.4 方法的精密度 取0.10 mg/ml的标准溶液进样6次，计算6次的平均值及相对标准偏差，观察该方法的精密度，如表3所示。标准溶液的相对偏差为0.07%。

2.5 方法的稳定性 绿原酸在光照下不稳定，取0.10 mg/ml的标准溶液于棕色瓶中避光保存，分别于0、1、2、5、10、20小时时测定样品的含量，测定结果如表4所示。平均峰值31054.5，标准偏差0.04%，结果表明绿原酸在避光下保存，20小时内基本稳定。

3 讨论

金银花又名忍冬，名字最早出自《本草纲目》，由于该花初为白色，随着时间延长，慢慢变为黄色，因此得名金银花，一般在三月开花，花有微香。金银花芳香透达，能祛邪，能宣散风热、清解血毒，可用于身热、发斑、热毒怆痛、发疹及咽喉肿痛等热性病，可作为药品、保健品、化妆品的原料[2]。

绿原酸为金银花中一种重要的生物活性物质，是金银花抗菌、抗病毒等的功能成分。不同时期的金银花中绿原酸含量有所不同，花蕾时期含量最高，至开放、枯萎，绿原酸含量呈下降趋势，一般在6.07%-4.29%[3]。绿原酸在医疗上具有较强的药理功能，能改善、修复人体消化系统以及血液系统，如绿原酸对人体急性咽喉炎症等有显著疗效，此外，绿原酸还具有止血、抗病毒、增高白血球等作用。

目前，金银花中绿原酸的提取方法主要有水提、醇提、薄层分析柱层析等，从经济、适用及安全各方面考虑，本文中用到的醇提方法提取率高，且提取过程中能有效的排除其他水溶性物质成分的干扰，减少绿原酸损失率，为一种高效的提取方法[4]。

随着科技的发展，对小分子功能成分的检测技术及分析技術得到了很大提高，绿原酸的检测从最初只能定性的定量法、比色法、分光光度计法等发展为不仅能够定性还能准确定量的高效液相色谱法。本文所用到的高效液相色谱法，不仅具有操作简单、技术成熟等特点，还有对其目标成分检测的回收率高、精密度高、重现性好等优点。

本文研究了高效液相色谱法分析测定金银花中绿原酸含量，我们采用50%甲醇，选用KQ-500B超声仪，在功率250W，频率35kHz下超声处理30分钟，提取金银花中绿原酸。通过紫外分光光度计扫描绿原酸标准溶液，发现其在327nm处具有最大吸收值，因此确定HPLC检测波长，并建立高效液相色谱条件，色谱柱采用C18柱，流动相为乙腈：0.4%磷酸溶液（13∶87），流速为1ml/min，进样量为10μl，柱温在30℃，检测波长为327nm，在此色谱条件下能有效的检测到绿原酸，样品保留时间在7min，绿原酸与邻近成分分离效果良好。并在0、1、2、5、10、20小时时分别测定样品的含量，平均峰值31054.5，标准偏差0.04%，表明稳定性良好。

目前，市场上金银花品种众多，然而其质量、品质差异巨大，甚至一些不良商家采用违法手段，如硫磺熏制，以改善花色品质，然而其功效成分绿原酸含量很低。本文旨在建立完善的绿原酸提取、检测方法，准确测定金银花中绿原酸的含量，监督、控制金银花品质质量，为人们高效利用金银花提供了一定的参考价值。

参考文献

[1] 聂凌鸿，岳淼.金银花中绿原酸提取工艺的优化[J].食品研究与开发，2008，29（1）：51-55.

[2] 国家药典委员会编.中华人民共和国药典（第一部）[M].化学工业出版社，2000，177.

[3] 周荣汉主编.中药资源学[M].北京：中国医药科技出版社，1993：426-433，179，85.

[4] 刘恩蕊，李青山.高效液相色谱法测定金银花有效部位中绿原酸的含量[J].山西医科大学学报，2006，37（2）：166-168.