复凝聚法制备苏云金杆菌微胶囊

李姗 王志英

摘要 [目的]探讨复凝聚法制备以明胶和阿拉伯胶为壁材的苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis，简称Bt）微胶囊的工艺。[方法] 通过单因素试验，研究了明胶浓度、阿拉伯胶浓度、芯壁比、pH、反应温度和转速对微胶囊包埋效率的影响，再通过正交优化试验确定最佳制备条件。利用光学显微镜、扫描电子显微镜和粒径测微仪对苏云金杆菌微胶囊形态及粒径分布进行表征。[结果] 复凝聚法制备苏云金杆菌微胶囊最佳工艺条件为明胶浓度1.0%，阿拉伯胶浓度1.0%，芯壁比1∶1，复凝聚反应pH 3.6，温度40 ℃，搅拌速度550 r/min。在此条件下的包埋率达82.32%，粒径分布均匀且平均粒径在28.29 μm左右流动性好的球型固体微胶囊。 [结论] 该微胶囊符合实际应用需求，为杀虫剂的研制提供了理论依据。

关键词 苏云金杆菌；明胶；阿拉伯胶；复凝聚法；微胶囊

中图分类号 S482.3 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）16-05020-04

苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis， Bt） 制剂是目前世界上研究最深入、产量最大、应用最广泛、对非目标生物无任何不利影响的微生物杀虫剂之一[1-2]，被广泛应用于农业、林业、卫生害虫的生物防治中。但由于苏云金杆菌制剂野外应用存在残效期短、防效不稳定、易受阳光、温度、湿度等外界条件制约等缺点[3]，笔者以明胶和阿拉伯胶为壁材，利用成囊技术包埋苏云金芽孢杆菌，制成微胶囊以提高菌体的稳定性、增强其耐紫外照射、耐高温的能力，便于对其保存和使用。

微胶囊技术包含物理法、化学法、物理化学法等[4]。复凝聚法是物理化学法中相分离法的一种，它利用2种带相反电荷的天然或合成的高分子材料在一定条件下相反电荷的高分子材料互相交联，形成复合物后溶解度降低自溶液中凝聚析出而成囊。复凝聚法是制备微胶囊的重要方法之一，在国内外已有广泛的应用和研究，主要用于医药、农药、食品、肥料等領域。国内，范光龙等[5]以明胶与阿拉伯胶作为壁材，制备薄荷油微胶囊，含油量为90.2%。孙锋等[6]以香蕉油香精为芯材，阿拉伯胶、氧化淀粉和明胶为壁材，包埋率达50%，所得薄荷油微胶囊和香蕉油香精微胶囊都降低其常温下的挥发，提高了薄荷油和香蕉油香精的稳定性。李武明等[7]探讨了以壳聚糖及海藻酸钠为壁材制备耐酸的双歧杆菌微囊效果最佳。李鹤等[8]以明胶和阿拉伯胶为壁材制备昆虫蜕皮激素微胶囊，包覆率为63.4%。马丽杰等[9]和周小敏等[10]分别以壳聚糖和木质素磺酸钠，明胶和阿拉伯胶为囊材将阿维菌素包埋成微胶囊，包埋率均超过82%。陆继锋等[11]以有机磷杀虫剂辛硫磷为囊芯采用复凝聚法制备辛硫磷微胶囊，增强了囊芯的稳定性，延长了杀虫剂的药效。在国外，复凝聚法制备的微胶囊剂也广泛应用于各个行业。CHANG等[12]以明胶和阿拉伯胶为壁材，樟脑油为芯材，制备微胶囊，包埋率达到 99.6%；通过油溶性的聚苯乙烯，改善樟脑油微胶囊的缓释效果。目前，复凝聚法中最常见的壁材有明胶、阿拉伯胶、壳聚糖、木质素磺酸钠、海藻酸钠等，笔者以明胶（GE）和阿拉伯胶（AG）为壁材[13]，探讨了壁材浓度、壁材比例、芯壁材比、pH、反应温度和转速等因素对复凝聚过程的影响，确定了苏云金杆菌微胶囊的制备体系，表征苏云金杆菌微胶囊的微观结构，为开发新型微生物农药提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 菌种：苏云金杆菌库斯塔克亚种（Bacillus thuringiensis subsp.kurstaki，Btk，质量50 000 IU/mg；湖北康欣农用公司）。

试剂：明胶（SIGMA.ALDRICH），阿拉伯胶（AMRESCO），吐温80（AMRESCO），戊二醛（国药集团化学试剂有限公司），冰乙酸（国药集团化学试剂有限公司），氢氧化钠（天津广成化学试剂有限公司），其余试剂购自于天津广成化学试剂有限公司，去离了水（实验室自制）。

仪器：电子天平（AR2130，梅特勒-托利多仪器有限公司），磁力搅拌器（德国SLK），电动搅拌器（德国 CY1L6.PS.NCY1L6H.A.N），高速离心机（D.37520，德国Osterode公司），电子扫描显微镜（JSM.6460LV，日本JEOL），激光粒度分析仪（ BT.9300H，丹东市百特仪器有限公口），电热恒温鼓风干燥箱（上海齐欣科学仪器有限公司，DHG.9030A北京），pH计，生物显微镜（奥林巴斯有限公司上海分公司）。

1.2 苏云金芽孢杆菌微胶囊的制备 把苏云金芽孢杆菌菌粉配成一定浓度的菌液，加入一定量20%Tween 80，置于磁力搅拌器进行搅拌，搅拌速度控制在低速300 r/min，制成苏云金芽孢杆菌悬浮液。镜捡菌液分散均匀后加入适量的明胶水溶液，温度缓慢升至40 ℃恒温，待体系搅拌一段时间后，将等量的阿拉伯胶水溶液加入到上述乳液中并调整转速到400 r/min，搅拌均匀后，缓慢滴加10%醋酸溶液调节系统pH至4，一段时间后，继续搅拌，将体系置于冰浴中，使温度降到5～10 ℃，加入10%的NaOH溶液调节pH至8～9，加入一定量的固化剂戊二醛（25%）溶液1 ml低温下搅拌1 h后，取出微胶囊溶液进行离心处理，用去离子水将离心管下方的微胶囊沉淀洗涤，最后得到的微胶囊室温晾干，干燥后的物质为苏云金芽孢杆菌微胶囊粉末，4 ℃下保存。

1.3 苏云金芽孢杆菌微胶囊的形态特征观察 将所制微胶囊悬浮液滴一滴到载玻片上，用光学显微镜观察微胶囊的形态。在扫描电子显微镜样品台上贴一层双面胶将微胶囊粉末轻轻撒在上面，轻轻吹去多余的粉末，离子溅射仪镀金1 min后，在扫描电子显微镜下对微胶囊的表面形态和粒径进行观察。

1.4 苏云金芽孢杆菌微胶囊包埋率的测定 取0.1 g菌粉配成菌悬液，测其菌数（B0），另取同样重量的菌粉所制微胶囊等体积溶液，测其菌数（B1），则包埋率=1-B1/B0[14]。

1.5 粒径检测 采用BT.2003型激光粒度分布仪进行测定，每个样品测定3次。

1.6 单因素优化微胶囊制备工艺

1.6.1 明胶浓度对微胶囊形成的影响。选取明胶浓度0.5%、1.0%、2.0%、3.0%和4.0%，阿拉伯胶浓度1.5%，芯壁比1∶1，成囊pH3.5，反应温度40 ℃，搅拌速度500 r/min，反应结束后沉淀洗涤，测定包埋率。

1.6.2 阿拉伯胶浓度对微胶囊形成的影响。选取阿拉伯胶浓度0.5%、1.0%、2.0%、3.0%和4.0%，明胶浓度1.5%，芯壁比1∶1，成囊pH3.5，反应温度40 ℃，搅拌速度500 r/min，反应结束后沉淀洗涤，测定包埋率。

1.6.3 芯壁比对微胶囊形成的影响。芯壁比选取3∶1、2∶1、1∶1、1∶2和1∶3，明胶浓度1.5%，阿拉伯胶浓度1.5%，成囊pH3.5，反应温度40 ℃，搅拌速度500 r/min，反应结束后沉淀洗涤，测定包埋率。

1.6.4 成囊pH对微胶囊形成的影响。pH选取3.0、3.4、3.8、4.2和4.6，明胶浓度1.5%，阿拉伯胶浓度1.5%，芯壁比1∶1，反应温度40 ℃，搅拌速度500 r/min，反应结束后沉淀洗涤，测定包埋率。

1.6.5 成囊温度对微胶囊形成的影响。反应温度选取30、40、50、60和70 ℃，明胶浓度1.5%，阿拉伯胶浓度1.5%，芯壁比1∶1，成囊pH 3.5，搅拌速度500 r/min，反应结束后沉淀洗涤，测定包埋率。

1.6.6 转速对微胶囊形成的影响。转速选取300、400、500、600和700 r/min，明胶浓度1.5%，阿拉伯胶浓度1.5%，芯壁比1∶1，成囊pH 3.5，反应温度40 ℃，反应结束后沉淀洗涤，测定包埋率。

1.7 正交优化微胶囊制备工艺 针对单因素影响因子的试验结果，选出对微胶囊包埋率影响较大的4个因素进行正交试验。选用L9（34）正交表进行试验，通过正交试验确定最佳的包囊条件，其试验因素水平见表1。

1.8 数据处理 数据均用平均值表示，采用Excel 2003和正交设计助手Ⅱ进行分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 明胶浓度对微胶囊形成的影响。由图1可知，微胶囊的包埋率随明胶浓度的增大呈先升高后下降的趋势，在浓度为1.0%时包埋率达72.44%。0.5%～4.0%明胶制成的微胶囊的包埋率分别为50.38%、72.44%、58.85%、42.30%和25.72%。由此可知，低浓度明胶溶液条件下制备出的微胶囊具有较高的包埋效率，低浓度有利于物质的溶解，易分散在体系里，与阿拉伯胶反应时能防止壁材过量而造成体系黏稠，但浓度太低也不利于微胶囊的形成，低浓度不能提供足够的电荷与阿拉伯胶反应。明胶浓度为0.5%、1.0%和2.0%的微胶囊包埋率高于明胶浓度为3.0%和4.0%的微胶囊。综上所述，低浓度明胶的微胶囊可以提高包埋率，高浓度的明胶不利于复凝聚反应的进行。同时造成囊壁致密，厚度增大，不利于囊芯的释放，浓度继续加大时，微胶囊之间还易出现粘连现象。因此，明胶的浓度应控制在0.5%～3.0%。

2.1.2 阿拉伯胶浓度对微胶囊形成的影响。由图2可知，随阿拉伯胶浓度的增大苏云金杆菌微胶囊的包埋率变化较大，在浓度为2.0%时包埋率最大71.10%。0.5%～4.0%胶浓度制成的微胶囊的包埋率分别为35.40%、66.45%、71.10%、34.11%和10.04%。由此可知，阿拉伯胶浓度为1.0%和2.0%所制微胶囊的包埋率高于阿拉伯胶浓度为0.5%、3.0%和4.0%的微胶囊，阿拉伯胶浓度为3.0%和4.0%时，溶液黏度增大易粘连。综上所述，阿拉伯胶浓度为1.0%～2.0%时有利于微胶囊形成。

2.1.3 芯壁比对微胶囊形成的影响。

3可知，随芯壁比的增大，包埋率呈先升后降的趋势，芯壁比为1∶1时微胶囊的包埋率最大为62.64%。芯壁比为1∶ 3、1∶ 2、1∶ 1、2∶ 1、3∶ 1时制成的微胶囊的包埋率分别为37.36%、51.03%、62.64%、25.97%和12.32%。由此可知，芯壁比为1∶1和1∶2的微胶囊的包埋率高于芯壁比为3∶1、2∶1和1∶3的微胶囊。综上所述，芯壁比过大，芯材过量会导致包埋率下降，壁材过少不能完全将芯材包覆，使得大量的囊芯粘在微胶囊表面，囊壁膜变薄。芯壁比过小，囊壁浓度过大也易粘连，形成的囊壁变厚，不利于囊芯的释放。

2.1.4 pH对微胶囊形成的影响。由图4可知，在pH为3.0～4.5时制成微胶囊的包埋率分别为67.18%、72.05%、79.16%、68.36%和50.38%。由此得知，随pH的增大包埋率先增大后减小，pH为3.4和3.8的微胶囊包埋率高于pH为3.0和4.2的微胶囊，在pH为3.8时微胶囊包埋率最高。这是由明胶和阿拉伯胶的性质所决定的，在水溶液中明胶分子中的正负电荷数量受介质pH的直接影响。当pH为3.0～4.2时明胶中正电荷达最大，在此条件下加入带负电荷的阿拉伯胶溶液，此时彼此的静电作用处于最理想状态，明胶和阿拉伯胶产生凝聚现象而形成微胶囊[4]。当pH小于3.0时，也不能得到聚合物，这是因为在较强酸性条件下，缩聚生成的微胶囊易分解为小分子。

2.1.5 温度对微胶囊形成的影响。由图5可知，反应温度从30～70 ℃，制成微胶囊的包埋率分别为53.66%、78.05%、64.33%、34.83%和20.76%。由此可知，40和50 ℃微胶囊的包埋率高于反应温度30和60 ℃的微胶囊，反应温度为40 ℃时包埋率最高为78.05%。综上所述，反应温度为40 ℃左右时有利于微胶囊形成。

2.1.6 转速对微胶囊形成的影响。由图6可知，微胶囊的包埋率随转速的增加呈先升高后降低趋势，500 r/min时包埋率最大为81.04%。制成的微胶囊的包埋率分别为42.99%、66.01%、81.04%、68.74%和53.99%。由此得知，搅拌速度为500和600 r/min条件下制备的微胶囊的包埋率高于搅拌速度为700 r/min条件下制备的微胶囊。表明低转速下有利于复凝聚反应的進行，高转速下易使反应体系紊乱，阻碍复凝聚反应的发生。因此，将搅拌速度控制在低转速下即可保证反应的正常进行。

2.2 正交试验结果 根据单因素试验结果，选取明胶浓度、阿拉伯胶浓度、pH、转速4个因素，以微胶囊包埋率为指标，设计L9（34）正交试验，试验结果见表2。

由表2可知，影响包埋率的各因素主次顺序为A >C >B >D，即明胶浓度的影响最大，其次是pH，阿拉伯胶浓度和转速对包埋效果的影响都较小，最佳组合为A1C2B1D3，即最佳包埋工艺条件为：明胶浓度1.0%、阿拉伯胶浓度1.0%、pH 3.6、转速550 r/min。并以此条件制备苏云金芽孢杆菌微胶囊。

2.3 苏云金芽孢杆菌微胶囊的形态特征 利用光学显微镜与扫描电子显微镜对最优条件下制备的苏云金芽孢杆菌微胶囊的微观结构和整体分布进行表征，结果见图7。由图7可知，在水分散体系中，苏云金芽孢杆菌微胶囊呈球形，单分散性好，形态规则，大小较均匀。由图8可知，苏云金芽孢杆菌微胶囊成囊性及密封性良好，囊皮材料包裹紧实，杂质残留较少。

2.4 苏云金芽孢杆菌微胶囊化的包埋率 采用血球计数板计数法，根据“1.4”中方法和公式计算出上述最优工艺条件下所制备的苏云金芽孢杆菌微胶囊的包埋率为82.32%。

2.5 粒径分布 利用激光粒度分析仪测定苏云金芽孢杆菌微胶囊的粒径大小，苏云金芽孢杆菌微胶囊粒径分布见图9。由图9可知，苏云金芽孢杆菌微胶囊粒径呈正态分布，大粒径的微胶囊极少存在。测出不同粒径的分布范围，得出中位径为28.29 μm。总含量90%微胶囊可通过300目的筛子。

3 结论与讨论

该研究以明胶和阿拉伯胶为壁材，苏云金芽孢杆菌为芯材，采用复凝聚法制备苏云金芽孢杆菌微胶囊，表征了微胶囊的超微结构、包埋率及粒径分布。结果表明，通过单因素试验和正交试验，得出影响微胶囊包埋率的主次顺序为明胶浓度>pH>阿拉伯胶浓度>转速。最佳工艺条件：明胶浓度1.0%，阿拉伯胶浓度1.0%，芯壁比1∶1，复凝聚反应pH 3.6，温度40 ℃，搅拌速550 r/min。在此工艺条件下得到的微胶囊产品的包埋率可达82.32%，粒径分布均匀且平均粒径在28.29 μm。包埋率是评价微胶囊化产品质量的指标，包埋率高，表明芯材大多被包埋在微胶囊壁基质内，留在微胶囊产品表面的芯材含量少。将苏云金芽孢杆菌微胶囊化，可减少孢子粉用量，提高芯材物质的稳定性，有效避免紫外照射[15-16]，缓慢释放且延长杀虫活性。减少了对人畜的刺激、环境的污染和对农作物的药害，是一种环境友好型制剂[17]。故对所制微胶囊剂的防紫外线程度、杀虫效果还有待进一步研究、完善。

参考文献

[1] 荣一兵.苏云金杆菌研究的历史和现状[J].黄石高等专科学校学报，2000（3）：33-35.

[2] 吴洪生.苏云金杆菌的发现和应用[J].生物学通报，2003（3）：15-16.

[3] 肖筠，黄世群，丁佶，等.微生物杀虫剂——苏云金杆菌（Bt）[J].四川农业科技，2008（4）：44-45.

[4] 许时婴，张晓鸣，夏书芹，等.微胶囊技术[M].北京：化学工业出版社，2006.

[5] 范光龙，张华.复凝聚薄荷油微胶囊的制备[J].天津工业大学学报，2009（5）：14-18.

[6] 孙锋，邱芳萍，王志兵.复凝聚法制备香蕉油香精微胶囊技术的研究[J].中国调味品，2009（3）：69-71.

[7] 李武明，张玲华，杨汝德.双歧杆菌的微囊化研究[J].广东药学院学报，1997（4）：14-17.

[8] 李鹤，迟德富，宇佳，等.复凝聚法制备昆虫蜕皮激素微胶囊及其性能[J].化工进展，2010（9）：1730-1736.

[9] 马丽杰，赵静.壳聚糖/木质素磺酸钠复凝聚法制备生物农药微胶囊[J].北京化工大学学报：自然科学版，2006（6）：51-56.

[10] 周小敏，于秋生，陈正行.复合凝聚法制备阿维菌素微胶囊[J].江苏农业科学，2013（6）：104-107.

[11] 陆继锋，金劲松.复凝聚法制备农药微脱囊的研究[J].安徽农业科学，1999（3）：201-203.

[12] CHANG C P，LEUG T K，LIN S M， et al.Release properties on gelatin-gum arabic microcapsules containing camphor oil with added polystyrene[J].Colloids and Surfaces B.Biointerfaces， 2006， 50：136-140.

[13] 韩路路，毕良武，赵振东，等.微胶囊的制备方法研究进展[J].生物质化学工程，2011（3）：41-46.

[14] 许燕滨，杨汝德，陈惠音.双歧杆菌微胶囊特性研究[J].四川食品与发酵，1998（4）：24-26.

[15] 游红，周兴苗，徐家文，等.抗紫外线降解苏云金芽胞杆菌微胶囊剂的制备工艺[J].华中农业大学学报，2009（3）：281-285.

[16] JOHNSON F S.Averagelatitudinal variation in ultraviolet radiation at the earths surface[J].Photochem Photobioll，1976， 23：179-188.

[17] 王利平，代林远，李鹏.苏云金芽孢杆菌研究进展[J].中国畜牧兽医，2011（9）：224-227.安徽农业科学，Journal of Anhui Agri. Sci.2014，42（16）：5033，5044

責任编辑 李占东 责任校对 况玲玲