产表面活性剂菌的筛选和验证实验研究

张夙夙

摘要 [目的]探究废弃钻井液中产表面活性剂菌株的性能。[方法]以废弃的钻井液为原材料，利用生物表面活性剂的性质进行产表面活性剂菌株的培养和筛选，并且将筛选出来的产表面活性剂菌进行排油活性和乳化性能的测定。[结果]筛选出的产表面活性剂菌排油圈的直径约为4 cm，乳化层初始较厚，1 d后变薄。[结论]筛选出的产表面活性剂菌排油活性较好，但乳化性能不稳定。

关键词 产表面活性剂菌；培养；筛选；验证

中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）16-04967-02

随着我国经济建设的发展，石油开采规模日益扩展，但是由于技术的落后与环保意识的缺乏， 土壤石油污染越演越烈，并且严重威胁到人们的生存环境和身体健康。油田中钻井、洗井、采油、运输、炼制等过程中会有数量不等的原油被排放到环境中，使得土壤受到不同程度的污染[1]。石油在土壤中的积累将导致土壤结构的破坏，影响土壤孔隙率，并且对农作物的生长和发育造成很大的负面影响[2]。同时，石油烃通过“土壤—植物—人”这一食物链进入人体内，危害人体健康[3]。所以，探究土壤石油污染的治理方法显得极为迫切。

各种修复技术各有所长也各有所短，其中微生物修复技术因其具有速度快、消耗少、效率高、成本低、反应条件温和以及无二次污染等优越性而被人们所提倡。微生物修复的一个关键技术就是生物表面活性剂的应用。生物表面活性剂能显著降低表面张力，提高不溶性石油组分的生物可利用性。与化学表面活性剂相比，生物表面活性剂具有特异性强、高效、低毒、不污染环境以及生产成本低等优点。因此，生物表面活性剂已被广泛地应用于石油污染土壤的修复实践中，显示出良好的应用前景。笔者以废弃的钻井液为原材料，利用生物表面活性剂的性质进行产表面活性剂菌株的培养和筛选，并且将筛选出来的产表面活性剂菌进行排油活性和乳化性能的测定。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 生物菌剂。以废弃的钻井液为菌源，以原油为唯一碳源进行菌株培养。

1.1.2 培养基。

1.1.2.1 细菌富集培养基。将KH2PO4 1.0 g、K2HPO4 1.0 g、NH4NO3 1.0 g、CaCl2 0.02 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、NaCl 10 g溶于1 L去离子水中，用 NaOH 调 pH 至 7.0。

1.1.2.2 血平板培养基。将牛肉膏0.3 g、蛋白胨1.0 g、酵母粉0.01 g、NaCl 0.5 g、琼脂粉2.0 g溶于100 ml 去离子水中。灭菌后将培养基冷却到50 ℃，然后按 8% （V/V）用量把绵羊血无菌操作加到冷却的培养基中，轻轻摇匀后倒平板即可。注意不要产生气泡。

1.1.2.3 蓝色平板培养基。将牛肉膏 0.3 g、蛋白胨 1.0 g、酵母粉 0.01 g、NaCl 0.5 g、琼脂粉2.0 g十六烷基三甲基溴化铵0.5 g、亚甲基蓝0.002 g溶于100 ml去离子水中，用 NaOH调pH至7.0，高压下蒸气灭菌20 min。待冷却后，轻轻摇匀后倒平板即可。

1.1.2.4 LB培养基。胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化钠10 g/L，用NaOH调节pH达7.4，高压下蒸气灭菌20 min。

1.1.2.5 复筛摇瓶培养基。将牛肉膏7 g、葡萄糖5 g、NaNO3 2.5 g、KH2PO4 4 g、K2HPO4 4 g、 CaCl2 0.1 g、MgSO4 0.2 g、 NaCl 1 g、 KCl 1 g溶于1 L去离子水中，用NaOH调pH至7.5，高压下蒸气灭菌20 min。

1.2 试验方法

1.2.1 采样。采集废弃的钻井液作为试验样品。

1.2.2 富集培养。称取10 g原油样品，用无菌水稀释100 ml，静置15 min。滤去沉淀，取滤液5 ml，加入装有95 ml富集培养基的250 ml锥形瓶中，加塞，32 ℃摇床培养2 d。

1.2.3 初步筛选。将富集培养的菌液梯度稀释至10～5，采用涂布法分别接种到血平板培养基和蓝色平板培养基上，放置在30 ℃培养箱中，培养2 d，观察菌落。在血平板培养基上，菌落周围会形成溶血圈；在蓝色平板培养基上，菌落周围会有蓝色的晕圈。

1.2.4 挑取再培养。用接种环挑取能够产生溶血圈的菌和周围有蓝色晕圈的菌，采用划线法分别接种到血平板培养基和蓝色平板培养基上进行培养。

1.2.5 LB培养基培养。挑选能产生溶血圈的和能产生蓝色晕圈的单菌落，接种到LB培养基，37 ℃条件下摇床培养24 h，做好标记，编号。

1.2.6 复筛摇瓶培养。用移液枪从LB培养基中抽取5 ml菌液至一灭菌的盛100 ml发酵培养基的250 ml三角锥形瓶中，32 ℃摇床培养3 d。

1.2.7 生物表面活性剂排油活性的测定。取一定量的发酵培养液，1 000 r/min离心10 min，得上清液，取直径为20 cm的培养皿，加入90 ml蒸馏水，并且加入0.5 g苏丹III染色，然后加入1滴柴油，待柴油均匀分布于水面上后，在柴油膜的中央慢慢加入80 μl上清液，觀察排油圈大小。

1.2.8 生物表面活性剂乳化性能的测定。取一定量的发酵培养液，1 000 r/min离心10 min，得上清液，取3 ml上清液与等体积的柴油，加到乳化管中，搅拌，混合均匀，制备悬浊液，观察乳化相和油相的体积变化以及乳化性能的稳定性。

2 结果与分析

2.1 产表面活性剂排油性检测 试验结果见图1。经测量，玻璃平皿的直径为20 cm，排油圈的直径约为4 cm。

2.2 产表面活性剂乳化性能的检验

2.2.1 初始相。由图2可知，乳化层较厚。

2.2.2 变化相。由图3可知，形成乳化层1 d后，乳化层变薄，说明该产表面活性剂菌的乳化性能不稳定。

3 讨论

以废弃的钻井液为原材料，利用生物表面活性剂的性质

图2 产表面活性剂乳化性能的检测（初始相）

图3 产表面活性剂乳化性能的检验（变化相）进行产表面活性剂菌株的培养和筛选，并且将筛选出来的产表面活性剂菌进行排油活性和乳化性能的测定。经测定，该试验筛选出来的产表面活性剂菌排油活性较好，但乳化性能不稳定。

参考文献

[1] 叶建阳，叶向德，郭军权.石油工程环境保护[M].杨凌：西北农林科技大学出版社，2010.

[2] 吕志萍，程龙飞.石油污染土壤中石油含量对玉米的影响[J].油气田环境保护，2001，11（1）：36-37.

[3] 马志华.石油对海洋环境造成的污染究竟有多大[J].森林与人类，2002（12）：8-9.