一株褐腐真菌产纤维素酶活力的分析

韩树英 池玉杰 薛煜

摘要 [目的]获得一株可降解纤维素的褐腐真菌，并且分析其产酶特性。[方法]从腐朽木材上分离出一株褐腐真菌，分析该菌株的形态学特征、生物学特性，并且通过液体发酵培养，测定该菌株的2种纤维素酶活力。[结果]该菌株为栗黑拟层孔菌。发酵试验表明，在初始pH 6.0、CMCNa 0.5 g/L、KH2PO4 0.5 g/L、CaCl2 0.5 g/L、VB1 0.5 g/L、MgCl2 2 mmol/L、酵母粉5.0 g/L、酒石酸铵0.5 g/L的条件下，培养5 d时纤维素酶活力最高，内切葡聚糖苷酶（CMCCase）为21.71 U/ml，β葡聚糖苷酶为10.69 U/ml。[结论]该试验为进一步研究褐腐真菌降解木质纤维素的机制提供前期基础。

关键词 褐腐真菌；液体发酵；纤维素酶

中图分类号 S188+.4 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）16-04953-03

木质纤维原料主要由纤维素（一种葡萄糖聚合物）、半纤维素（一种戊糖和己糖聚合物）及木质素（一种不规则苯丙醇单元聚合物）组成[1]。其中，纤维素又被称为“生物币”，是地球上最古老、最丰富的可再生生物资源，并且广泛存在于植物中[2]。有资料显示，植物每年产纤维素量约为1 800亿t，纤维素能够转化为可溶性糖、乙醇以及工业化合物等可利用产物[3]。从环保、高效的角度出发，纤维素被分解且无污染的一条有效途径就是利用纤维素酶的水解，其中采用微生物发酵是最方便的方法。纖维素酶主要由内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡聚糖酶3种酶组成，而大部分微生物如细菌、放线菌和真菌等能够产生纤维素酶。真菌中，已深入研究且作为水解纤维素的模式菌为软腐菌（Trichoderma viride）和白腐菌（Phanerochaete chrysosporium），但是对褐腐菌降解纤维素的研究较少[4]。笔者从长白山地区腐朽木材上分离出一株可以分解纤维素的褐腐菌。该菌株与其他63种菌株相比分解木材能力最强[5]，通过对其进行鉴定和优化培养，以期为真菌纤维素酶的研究和应用提供新的真菌资源。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源。东北林业大学林学院森林保护教研室保存菌种。

1.1.2 培养基。PDA培养基组成为：去皮马铃薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂 20 g/L。基础培养基组成为：CMCNa 5 g/L，KH2PO4 0.5 g/L，酵母 10 g/L，CaCl2 0.5 g/L，VB1 0.5 g/L。

1.1.3 DNS试剂的配制[6]。量取750 ml去离子水，加热至45 ℃时加入10.00 g 3，5-二硝基水杨酸，待完全溶解后依次加入100 ml 4 mol/L NaOH、5.00 g苯酚、5.00 g Na2SO3和300.00 g酒石酸钾钠，溶解后定容至1 L，将棕色瓶在室温、暗处放置7 d后使用。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种鉴定。采用18rRNA ITS基因序列分析。以基因组DNA为模板，采用通用引物ITS1（5′TCCGTAGGTGAACCTGCGG3′）和ITS4（5′TCCTCCGCTTATTGATATGC3′）进行PCR。扩增体系为：10×PCR Buffer 2.5 μl，dNTPs（2.5 mmol/L）1 μl，上游引物（20 μmol/L）1 μl，下游引物（20 μmol/L）1 μl，rTaq酶 0.25 μl，DNA模板 0.5 μl，去离子水补足至25 μl。反应条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 60 s，72 ℃ 2 min，共30个循环；72 ℃ 10 min。

1.2.2 葡萄糖标准曲线的制作。准确称取100 mg葡萄糖（预先在105 ℃烘干至恒重），用去离子水溶解后定容至100 ml，得到葡萄糖标准溶液。取标准溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 ml，加蒸馏水定容至2 ml，再分别加入3 ml DNS试剂，混匀后沸水浴5 min，立即冷却至室温，加蒸馏水至25 ml，摇匀，520 nm处测吸光值，以此制作葡萄糖标准曲线，计算出回归方程和回归系数。

1.2.3 粗酶液的制备。接种4 ℃保存的试管菌于PDA平皿中，28 ℃静止培养。待长满皿后用打孔器（直径9 mm）转接进PDA平皿中扩大培养。培养8 d后，取最外围菌饼接入含100 ml产酶液的250 ml三角瓶中，28 ℃、150 r/min培养。取发酵液于4 ℃下，10 000 r/min离心10 min，上清液即为粗酶液。

1.2.4 纤维素酶活力的测定。

1.2.4.1 内切葡聚糖苷酶（CMCCase）的测定[7]。取0.5 ml粗酶液，添加1 ml浓度1%CMCNa（用pH 5.0，50 mmol/L柠檬酸缓冲液溶解CMCNa），对照不添加酶液，50 ℃条件下反应30 min，立即加入3 ml DNS试剂，再于对照管中加入0.5 ml粗酶液，沸水浴5 min后取出，立即冷却至室温，定容至5 ml，于520 nm波长处测OD值。

1.2.4.2 β葡聚糖苷酶的测定。在离心管中加入1 ml浓度0.5%水杨苷柠檬酸缓冲液和0.5 ml酶液，50 ℃水浴30 min后取出，立即加入3 ml DNS试剂，再于对照管中加入0.5 ml粗酶液，沸水浴5 min，立即冷却至室温，定容至5 ml，在520 nm波长下测定OD值。以上酶活力单位（U/ml）定义为：在50 ℃条件下，每毫升酶液在1 min内催化底物生成1 μg葡萄糖所需的酶量。

1.3 产酶条件的优化

1.3.1 不同初始pH。以基础培养基为产酶培养基，初始pH分别调节为4、5、6、7。接入5块直径9 mm的菌饼于含50 ml发酵液的250 ml三角瓶中，150 r/min培养5 d，测定CMCCase。每个处理重复3次。

1.3.2 不同发酵时间。以基础培养基为产酶培养基，接入7块菌饼于含100 ml发酵液的250 ml三角瓶中，分别培养1、3、5、7和9 d，测定CMCCase、β葡聚糖苷酶酶活。

1.3.3 正交试验设计。在上述单因素试验的基础上，研究不同初始pH（A）、装液量（B）、氮源浓度（C）和接种量（D）4个因素对酶活的影响。按L9（34）正交表设计试验因素、水平见表1。

1.3.4 不同金属离子。在上述最佳条件下，分别添加MgCl2、ZnCl2、KCl、NaCl和MnCl2，培养5 d后测定CMCCase、β葡聚糖苷酶酶活。

1.3.5 不同N源。在上述最佳条件下，分别以尿素、酒石酸铵、磷酸铵、NH4NO3、（NH4）2SO4为氮源，培养5 d后测定CMCCase、β葡聚糖苷酶酶活。

1.3.6 不同氨基酸。以上述获得的最佳培养基为产酶培养基，分别加入亮氨酸、泛氨酸、烟酸、谷氨酸、苏氨酸，培养5 d后测定CMCCase、β葡聚糖苷酶酶活。

1.4 分析方法 运用SPSS进行数据分析，用Excel进行作图[8]。

2 结果与分析

2.1 菌株ITS序列鉴定[9] 将测序结果提交到NCBI的GenBank中，得到登陆号为JX863102.1，在线进行Blast分析，结果显示与该褐腐菌相似性最高的菌株均属于Fomitopsis属，与栗生灰黑孔菌Melanoporia castanea相似性达99%。利用MEGA 5.2的NeighborJoining 构建系统进化树，结果如图1所示。菌株CY2012占据着一个独立的分支，可能为一个新的亚种。

2.3.1 不同初始pH对产酶条件的影响。为了探索不同初始pH对褐腐菌发酵产纤维素酶能力的影响，将菌株置于不同的pH条件下进行发酵。由图3可知，当初始pH为6.0时，产CMCCase最高，酶活为12.62 U/ml。在pH 4.0～6.0时，随着pH的增加，产酶量逐渐提高。通过显著性分析，发现在pH 4.0～6.0时，差异不显著，说明该菌株在4～6之间有利于产生CMCCase；当pH高于6.0时产酶量急剧下降，说明该菌适宜在偏酸环境下生长。

注：图中不同小写字母表示差异在0.05水平显著。

图3 初始pH对产酶条件的影响2.3.2 不同发酵时间对产酶的影响。在不同培养时间，检测CMCCase、β-葡聚糖苷酶酶活的大小。由圖4可知，在培养的第1天，在发酵液中已经检测到酶活，到第5天时产酶开始显著升高，CMCCase酶活为19 U/ml；到第9天时，酶活基本达到稳定。β-葡聚糖苷酶在第9天时最高，酶活为6.14 U/ml。为了缩短培养时间，同时得到高产量的酶活，选取第5天为最佳产酶时间。

注：图中不同小写字母表示差异在0.05水平显著。

图4 不同培养天数对产酶的影响2.3.3 正交试验。由于pH在4～6时差异不显著，选取pH、装液量、氮源浓度和接种量为研究对象，按L9（34）正交表进行试验，在第5天时检测CMCCase酶活。试验结果及分析见表2。采用直观分析法分析结果，发现第8组A3B2C1D3产酶量最高，酶活为18.05 U/ml。由方差分析可知，接种量、pH对褐腐菌产CMCCase的影响最大，酵母浓度次之，装液量对产酶影响最小，从而得到最优产酶组合为A3B3C1D3。

2.3.4 不同金属离子对菌株产酶活力的影响。由图5可知，MgCl2和KCl有利于产CMCCase酶，酶活分别为19.57、18.57 U/ml，NaCl抑制CMCCase酶的产生，但是有利于β-葡聚糖苷酶的产生。MgCl2最有利于β-葡聚糖苷酶的产生，酶活为6.80 U/ml。显著性分析结果表明，ZnCl2对CMCCase酶和β-葡聚糖苷酶的产生量最少。

注：图中不同小写字母表示差异在0.05水平显著。

注：图中不同小写字母表示差异在0.05水平显著。

g/L，VB1 0.5 g/L，pH 6.0，每250 ml三角瓶装100 ml发酵液，同时添加0.5 g/L MgCl2，接种7块菌饼，添加不同的无机氮源，注：图中不同小写字母表示差异在0.05水平显著。

由图7可知，当添加尿素时，菌株几乎不产生CMCCase酶；酒石酸铵最利于产（上接第4955页）

CMCCase酶和β-葡聚糖苷酶，酶活分别为21.71、10.69 U/ml。

3 讨论

通过形态鉴定、生物学分析，确定该褐腐菌为栗黑拟层孔菌（Fomitopsis sp.CY2012），在系统进化树上处于一个单独的分支，可能是一个新的亚种。该菌株是64种腐朽菌中降解木材最高的一种。通过发酵培养，发现该菌株几乎不产滤纸酶。真菌是VB1的天然缺陷型。它们以一种辅酶的形式存在，对真菌的生长很重要。因此，在发酵培养基中添加VB1，有利于菌株良好的生长[10]。由于该菌不像木霉一样能够产生大量的孢子，接种时以菌饼为主，且选取平皿中最外围新生的菌丝。在优化前，CMCCase酶活约为8 U/ml，优化后为21.71 U/ml，提高了3倍左右。该菌产β葡聚糖苷酶较低，添加氨基酸后产量明显增加。尿素和NaCl都会抑制CMCCase酶的产生，但对β-葡聚糖苷酶的产生无抑制作用。

近年来，对木霉发酵产纤维素酶的培养条件的研究很多，但是有关腐朽菌产纤维素酶的研究较少[11]。该研究通过对褐腐菌产纤维素酶液体发酵条件进行优化，为进一步研究腐朽菌降解纤维素机制提供前期基础。

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责任编辑 刘月娟 责任校对 况玲玲