热处理对枣果肉中纤维素酶、多聚半乳糖醛酸酶活性及底物含量的影响

崔升+张娜+许建+于宁+韦玉龙+黄雪娇+李焕荣

摘要： 为获得枣最佳的工艺参数，以山东冬枣为原料，通过热处理研究冬枣中纤维素酶（Cx）、多聚半乳糖醛酸酶（PG）活性的变化及纤维素、果胶的保留量，利用响应面分析法设计3因素3水平的优化试验，结果表明，热处理时间 4 min、处理温度93 ℃、投料量27 g/L为最佳的热处理条件，此条件下纤维素酶（Cx）和多聚半乳糖醛酸酶（PG）被灭活，纤维素和果胶保留量分别为0.647 0 D620 nm/g和0.085 9%。

关键词： 冬枣；热处理；酶活；果胶；纤维素酶；多聚半乳糖醛酸酶

中图分类号： S665.101；TS201.1 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2016）03-0279-05

冬枣别称苹果枣，含有丰富的维生素A、维生素E及钾、钠、铁、铜等多种矿物质元素。鲜冬枣皮薄、肉脆、质优、味甘的特异品质，在古代被钦定为“贡品”[1]。果实质地是构成果实品质的重要因素，而采后冬枣很容易软化、腐烂，致使各种营养成分大量丧失。目前研究认为，果实的软化是由构成细胞间层及细胞壁的果胶降解所致，而果胶的分解与多聚半乳糖醛酸酶（PG）的活性有密切的关系[2-4]。与此同时，纤维素的降解也会促进果实的软化，而调节纤维素降解的水解酶主要是纤维素酶（Cx）[4]，鳄梨的软化就是纤维素酶在起作用[5]。本试验通过对冬枣进行热处理，分析其多聚半乳糖醛酸酶、纤维素酶活性及果胶、纤维素含量的变化，以寻求最佳的热处理条件，使PG 和Cx这2种酶被灭活的同时果胶和纤维素保留量最高，为果蔬热处理技术进一步提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

冬枣，产自山东沾化。选择着色度为20%～60%的半红枣，手工采摘以防造成机械损伤；0～4 ℃保藏，待用。

0.15%咔唑、100 μg/mL半乳糖醛酸标准液、浓硫酸（分析纯）、50 mmol/L pH值为5.5的醋酸钠缓冲液、1.8 mol/L NaCl、1%多聚半乳糖醛酸溶液、3，5-二硝基水杨酸（DNS）试剂、50 mmol/L pH值为5.0的柠檬酸缓冲液、1%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）溶液。

TU-1810型紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器责任有限公司生产；HH-S4型数显恒温水浴锅，金坛市医疗仪器厂生产；SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司生产；TGL-16aR型冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂生产；含研钵组织捣碎机；FE20K Plus型pH计，梅特勒-托利仪器有限公司生产。

1.2 试验方法

1.2.1 工艺流程 原料选择→拣选→清洗→切片→热处理→热风干燥→打粉→包装。

1.2.2 操作要点 拣选无机械损伤、无病虫害、着色度为20%～60%且大小均匀的红枣，用去孔器将红枣的核去掉；顺着核孔垂直切片，枣片厚度为3 mm左右；将定量的枣片装入纱布网中，确保网内空间足够大，避免枣片上浮于水面；将纱布网放入设定并达到温度的水浴锅中，水浴锅中水量按料液比设定；达到处理时间后迅速取出，并用液氮冷冻，低温存放备用。

1.2.3 热处理单因素试验设计

1.2.3.1 料液比的选择 以Cx、PG酶活性和纤维素、果胶保留量为指标，处理温度为85 ℃、时间为4 min，液料比（mL ∶ g）分别为20 ∶ 1、40 ∶ 1、60 ∶ 1、80 ∶ 1、100 ∶ 1。

1.2.3.2 处理时间的选择 以Cx、PG酶活性和纤维素、果胶保留量为指标，处理温度为85 ℃、液料比为40 mL ∶ 1 g，处理时间分别为1、2、3、4、5 min。

1.2.3.3 处理温度的选择 以Cx、PG酶活性和纤维素、果胶保留量为指标，处理时间为4 min、液料比为40 mL ∶ 1 g，处理温度分别为75、80、85、90、95 ℃。

1.2.4 响应面试验设计 在单因素试验基础上，选取处理温度、处理时间、料液比3因素为自变量（表1），分别以Cx活性、PG活性、纤维素含量、果胶含量为响应值，根据Design-Expert 8.0.5b软件Box-Behnken的试验设计方法，设计3因素3水平共17个试验点的响应面分析试验，其中12组是析因试验，5组是中心试验。

1.2.5 测定指标及方法 果胶含量、Cx酶活性和PG酶活性的测定参照曹建康等的方法[6]；纤维素含量测定参照李合生等的方法[7-8]，并进行部分修改。准确称量2 g枣果置于冰水浴的烧杯中，用60 mL 60%硫酸溶液消化30 min；转入100 mL 的容量瓶中，用同一浓度硫酸定容至刻度线；用布氏漏斗过滤，取溶液5 mL用蒸馏水定容至100 mL，摇匀；取溶液2 mL于比色管中，加0.5 mL 2%蒽酮试剂，再缓慢加入 5 mL 浓硫酸，摇匀；静置12 min，波长620 nm下测吸光度。

1.2.6 数据统计分析 采用Design-Expert 8.0.5b数据处理软件进行响应面分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 料液比对冬枣片热处理的效果 由图1可见，随料液比的增大，纤维素酶（Cx）、多聚半乳糖醛酸酶（PG）的活性越高；液料比为20 mL ∶ 1 g和40 mL ∶ 1 g时，2种酶的活性变化不大，说明此时枣片的添加量基本不会影响酶活性的变化；随料液比的增大，纤维素和果胶保留量下降明显，这可能是因为料液比增加使水温下降，致使酶能够长时间保持较高的活性，促进了纤维素和果胶的分解，而液料比为20 mL ∶ 1 g和40 mL ∶ 1 g时，酶的活性降低很快，故而纤维素和果胶保留量较高。考虑实际操作和人力、物力消耗，选择液料比为40 mL ∶ 1 g较合适。

2.1.2 热处理时间对冬枣片的影响效果 由图2可见，随热处理时间的延长，酶活性总体呈下降趋势，相应的纤维素和果胶的保留量也逐渐减少，5 min时保留量下降明显，这可能是纤维素和果胶溶解到热水中的缘故。因此，选择热处理时间为4 min较合适。

2.1.3 热处理温度对冬枣片的影响效果 由图3可见，热处理温度越高，酶的活性越低，75～90 ℃酶活性急剧下降，90～95 ℃酶活变化趋于平缓；90 ℃处理时纤维素和果胶的保留量最高，95 ℃时有所降低，这可能是因为高温促进纤维素和果胶热分解的发生[9]。因此，选择处理温度为90 ℃较合适。

2.2 响应面分析

2.2.1 模型建立及显著性检验 利用软件对试验结果（表2）进行拟合，得到热处理时间（A）、热处理温度（B）、料液比（C）分别与纤维素酶活性、果胶酶活性、纤维素含量、果胶含量的二次多项回归方程为：Cx酶活=0.037-0.039A-0.22B+0032C-0.097AB+0.039AC-0.018BC+0.072A2+0.19B2+0.037C2；PG酶活=0.037-0.033A-0.24B+0.085C-011AB+0.05AC-0.074AB+0.082A2+0.21B2-0.032C2；纤维素保留量=0.64-0.000 125A+0.022B-0.017C-0001 5AB+0.013AC+0.005 25BC-0.008 45A2-0.024B2-0.013C2；果胶保留量=0.085+0.000 0625A+0.003 125B-0001 888C+0.000 375AB+0.001 35AC+0.001 075BC-0001 785A2-0.002 71B2-0.001 085C2。

统计分析表明，回归模型均显著（P<0.05），失拟项不显著（P>0.05），这说明方程拟合性较好，可用回归方程来预测实际的试验结果（表3至表6）；纤维素酶活性、果胶酶活性、纤维素含量、果胶含量的二次多项回归方程决定系数R2分别为0.934 8、0.949 5、0.975 7、0.951 7，不良适配度仅分别为0.065 2、0.050 5、0.024 3、0.048 3，这说明响应值与自变量之间的回归系数呈现较高比例，回归线与回归数据之间适配度较好；信噪比分别为10.349、11.760、18.986、11.846，均大于4，这说明4个模型均可以准确反映试验结果。由表3可见，处理温度、处理温度和时间的交互项、处理温度的二次项对Cx酶活性的影响显著，P值分别为0.000 1、0.047 1、0.002 0，均小于0.05；由表4可见，处理温度、处理温度和时间的交互项、处理温度的二次项对PG酶活性的影响显著，P值分别为<0.000 1、0.027 9、0.001 0，均小于0.05；由表5可见，处理温度、处理时间和料液比的交互项、处理温度的二次项对纤维素保留量影响显著，P值分别为<0.000 1、0.003 5、<0.000 1，均小于0.05；由表6可见，处理温度、料液比、处理时间和料液比的交互项、处理时间的二次项、处理温度的二次项对果胶保留量影响显著，P值分别为0.000 1、0.002 1、0.046 9、0.013 7、0.001 6，均小于0.05。

2.2.2 各因素交互作用的影响 采用Design Expert 8.0.5 b软件，按照回归方程式绘制等高线图和响应面图（图4至图7）。从等高线可以观察交互影响效应的强弱，圆形表示2个因素交互影响作用不显著，而椭圆形则表示2个因素交互影响作用显著。响应面图是依照响应值对各试验因子构成的三围空间曲面图形，可以形象地看出各参数间的相互作用及最佳参数，当特征值均为正值时，响应面图表现为山谷形曲面，存在最小值，当特征值均为负值时，响应面图表现为山丘形曲面，存在最大值，当特征值有正值、有负值时，响应面图表现为鞍马形曲面，无极值存在，从经济角度考虑，响应面0点水平的处理条件较为合适。

通过等高线图可见，热处理时间和热处理温度2个因素的交互作用对Cx酶和PG酶活性影响显著，热处理时间和料液比2个因素的交互作用对纤维素和果胶保留量影响显著；从响应面图可见，各因素水平过高或过低，对考察指标均有不利影响，处理温度高、处理时间长能够很好地将酶灭活，但处理温度升到95 ℃，其果胶和纤维素保留量有下降的趋势（图4至图7），这可能是高温使果胶和纤维素发生热分解，而时间越长溶出量越大，从而导致保留量下降。

2.2.3 反应条件优化及模型验证 通过数学模型及响应面分析得出，枣热处理的最佳工艺条件为：处理时间3.80 min、处理温度92.12 ℃、料液比27.42 g/L，此条件下PG酶和Cx酶被灭活，纤维素和果胶保留量分别为0.654 D620 nm/g、0.086 4%。为实际操作方便，将热处理条件调整为：处理时间4 min、处理温度93 ℃、料液比27 g/L，经5次平行试验发现，此条件下Cx酶和PG酶被完全灭活，纤维素和果胶保留量分别为0.647 D620 nm/g、0.085 9%，与预测值相差较小。

3 结论

试验利用Design-Expert 8.0.5 b软件设计响应面，优化热激处理工艺条件，并进行试验验证，得到枣最佳提取工艺条件为：处理时间4 min、处理温度93 ℃、料液比27 g/L，此条件下Cx酶和PG酶被完全灭活，纤维素和果胶保留量分别为 0.647 D620 nm/g、0.085 9%，这可为相关生产加工提供理论参考和借鉴。

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