超高效液相色谱—串联质谱联用法测定香精香料中的香豆素和黄樟素

黄善松　范忠　黄世杰等

摘要 [目的]准确快速地测定香精香料中的香豆素和黄樟素。[方法]以60%乙醇水溶液为溶剂，样品经振荡萃取后，提取液经0.22 μm滤膜过滤，采用超高效液相色谱-串联质谱联用法（UPLCMS/MS）测定香豆素和黄樟素。[结果]该方法回收率的结果在95.0%～99.4%，日内、日间测定结果的变异系数分别小于6%和8%，香豆素和黄樟素的定量限分别为77.0和68.1 μg /kg。[结论]该方法可有效去除杂质干扰，分析时间短，具有高灵敏度、高精密度、高准确度等优点，适用于香精香料中的香豆素和黄樟素的测定。

关键词 香豆素；黄樟素；香精香料；超高效液相色谱-串联质谱联用法

中图分类号 S609.9 文献标识码

A 文章编号 0517-6611（2014）20-06805-02

UPLCMS/MS Determination of Safrole and Coumarin in Flavor

HUANG Shansong， FAN Zhong et al （Technical Center of China Tobacco Guangxi Industrial Co.， Ltd.， Nanning， Guangxi 530001）

Abstract [Objective] The research aimed to obtain accurate and rapid determination of Safrole and Coumarin in flavor.[Method] With 60% ethanol water solution as solvent， the sample was extracted and oscillated， the solvent was filtered with 0.22 μm filter membrane.Safrole and Coumarin was determined by UPLCMS/MS，. [Result] The limit of quantifications of Safrole and Coumarin were 77.0 and 68.1 μg /kg， respectively.The intraday and interday precision was less than 6% and 8%， respectively.The recoveries of the spiked sample wre 95.0% to 99.4%. [Conclusion] The method effectively removed impurities and reduced extremely the preprocessor time.It was concluded that the method had high recovery， high sensitivity and good reproducibility.The developed analytical method had been applied successfully to the determination of Safrole and Coumarin in flavor.

Key words Safrole； Coumarin； Flavor； UPLCMS/MS

基金項目 广西区科技厅科技攻关项目（桂科攻11194006）。

作者简介 黄善松（1971- ），男，广西桂林人，工程师，从事卷烟产品方面的研究。*通讯作者，从事烟草化学研究。

收稿日期 20140610

美国食品和药品管理局（FDA）早在1954年就禁止在食品中添加香豆素，英国食品标准化委员会也于1965年就将香豆素列为禁止在食品中使用的添加剂，我国也禁止将其作为食品添加剂[1]。黄樟素主要来源于植物精油，曾用作饮料和食品中香料[2]。黄樟素能在肝组织中形成黄樟素-脱氧核糖核酸（DNA）加合物，食物中黄樟素的含量在0.5%以上时引起肝细胞瘤，有致癌作用，是消化系统、血液系统、泌尿系统的强致癌物，世界各国均禁止使用[3]。在香精、香料生产过程中有可能由天然植物精油带入黄樟素、香豆素等成分，因此对香精香料中香豆素和黄樟素进行测定和质量控制是非常必要的。

目前，香豆素和黄樟素的测定方法主要有气相色谱[4]、液相色谱[5-6]和气相色谱-质谱联用法[7]、气相色谱-串联质谱法[8-9]。超高效液相色谱-串联质谱联用法具有更好的分离度和选择性、更高的灵敏度和更快的分析速度。但目前采用超高效液相色谱-串联质谱联用法同时测定香精香料中黄樟素和香豆素的方法未见报道。因此，笔者采用超高效液相色谱分离，电喷雾串联质谱进行定性和定量，建立了灵敏度高、准确可靠的超高效液相色谱-串联质谱联用（UPLCMS/MS）的测定方法。

1 材料与方法

1.1 材料 主要仪器：Agilent 1290 超高效液相色谱仪，美国Agilent 公司；API 3200三重四极杆串联质谱联用仪，美国AB公司；多功能全自动振荡仪；分析天平（感量0.1 mg）。

主要试剂：

香豆素、香豆素d4，购自Dr.Ehrenstorfer GmbH公司，纯度≥98%；黄樟素购自迪马公司，纯度≥97%；乙腈为色谱纯，水为去离子子水，其他试剂均为分析纯。

1.2 供试溶液的制备 称取香豆素0.01 g，黄樟素0.01 g，精确至0.000 1 g，以60%乙醇水溶液定容至500 ml，再通过稀释配含黄樟素和香豆素分别为5 μg/ml；称取一定量香豆素d4，用60%乙醇水溶液配制浓度为125 μg/ml的内标溶液。

1.3 样品前处理

称取约0.3 g（精度0.001 g）香精香料于50 ml三角瓶中，加入40 μl内标溶液，然后用移液管移取10 ml 60%乙醇水溶液，振荡萃取10 min，转速150 r/min，取上层清液，经0.22 μm尼龙滤膜过滤后，供UPLCMS/MS测定。

1.4 分析条件

色谱条件：色谱柱为Agilent ZORBAX StableBond SBC18色谱柱 （100 mm×2.1 mm， 粒径1.8 μm）；进样量5 μl；柱温为40 ℃；流动相为0.2%甲酸溶液-乙腈（体积比40∶60），等梯度洗脱；流速为0.25 ml/min，总分析时间为5 min。

质谱条件： 质谱检测采用ESI 离子源，在正离子检测方式下，选择MRM工作模式进行二级质谱分析，优化后的主要质谱条件为：雾化气

3.45×105Pa，辅助加热气3.45×105Pa，气帘气6.89×104Pa，电喷雾电压5 000 V，干燥温度600 ℃。具体化合物的MRM分析参数见表1。

2 结果与分析

2.1 质谱条件的优化

在正离子模式下以流动注射的方式先对1 mg/L香豆素等目标化合物的标准溶液进行母离子全扫描，确定其母离子，然后分别以其分子离子选择其子离子（碎片），每種物质先选择2个碎片，再从中选取信号较强、又无互相干扰的碎片定性和定量参数（表1）。

2.2 色谱条件及色谱柱的选择

在流动相中加入0.2%甲酸水溶液有助于香豆素等目标化合物[M+H]+母离子的形成，并能增强检测的灵敏度。

为选择适宜的色谱柱，对3种类型的色谱柱：ZORBAX StableBond SBC18 柱、ZORBAX Eclipse Plus C18柱和 Waters Symmetry C18柱的分离效果进行了比较。结果显示，ZORBAX StableBond SBC18 柱可以实现香豆素和黄樟素的良好分离，且峰形好，分析时间短（图1）。

2.3 提取液的考察

该试验考察了不同体积比甲醇水溶液、不同体积比乙醇水溶液作为提取溶剂的提取效率。结果发现，60%乙醇水溶液的提取效果较好，回收率高，还可降低样品中有机杂质进入色谱柱中的量，减少基质效应，并有效保护色谱柱。因此，该方法选择60%乙醇水溶液作为提取液。

2.4 标准曲线、方法检测限

取混合储备液0.05、0.10、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00 ml，各加入内标溶液40 μl，用60%乙醇水溶液定容至10 ml，摇匀，得7级工作标准溶液。对上述系列标准溶液进行UPLCMS/MS 分析，以目标物与内标的峰面积比值对二者相应的浓度比值进行线性回归分析，得到标准曲线、线性范围和相关系数（表2）。以3倍信噪比（S/N）为检测限，10倍信噪比（S/N）为定量限，结果见表2。

2.5 精密度和回收率试验

精密度试验：取同一样品进行5次日内和日间平行测定，考察了方法的精密度，得出该方法日内、日间测定结果的变异系数分别小于6%和8%，说明该方法精密度高。

回收率试验：在高（样品中目标物含量2倍）、中（样品中目标物含量1倍）、低（样品中目标物含量0.5倍）3个水平上进行了样品加标回收率的测定。结果表明，回收率的结果在95.0%～99.4%，回收率良好。

2.6 实际样品的测定

采用该方法对市场上的80多种香精香料样品进行香豆素和黄樟素的检测，其中3个样品中检出香豆素（含量分别为137.1、456.0、25.1 mg/kg），1个样品中检出黄樟素（含量为141.5 μg/kg）。

3 结论

该试验建立了快速准确测定香精香料中的香豆素和黄樟素的UPLCMS/MS测定方法。该方法简便、快速、准确，日