利用SRAP标记对牡丹杂交亲和性的分析

孙逢毅 李玲 石良红 赵兰勇

摘要：为了探究不同杂交组合结实率与亲本亲缘关系之间的联系，了解牡丹杂交亲和性的影响因素，以16个牡丹品种为试材，进行杂交试验。并利用SRAP分子标记技术分析品种间亲缘关系。结果表明，杂交亲本的相似系数在0.31~0.35时结实率较高。针对实际育种目标，提出了牡丹亲本搭配策略，在保证满足育种要求的前提下，为获得更多的杂交种子。应尽量选择亲缘关系稍远的品种形成杂交组合。

关键词：牡丹；亲缘关系；结实率；亲本搭配

中图分类号：S685.11文献标志码：A论文编号：2013-0897

0引言

牡丹(Paeonia suffruticosa Andr.)为芍药科(Paeoniaceae)芍药属(Paeonia L.)落叶灌木[1-2]，是中国的传统名花，牡丹育种一直受到国内外高度重视。要想获得更多不同类型的牡丹品种，需要进行定向育种，这方面在中国研究非常欠缺。相关序列扩增多态性SRAP标记是由美国加州大学蔬菜作物系Li and Quiros[3]提出。该标记多态性高、重复性好、操作简单、没有物种特异性，引物较ISSR更具随机性[4]。现已广泛应用于种质鉴定[5]、图谱构建[6-7]、比较基因组学[8]和遗传多样性分析[9]。牡丹方面，如Han等[10]利用SRAP技术分析中国牡丹品种‘洛阳红、‘二乔与日本牡丹品种‘太阳、‘岛锦间的差异；王娟等[11]利用SRAP技术对20个牡丹品种进行基因组DNA多态性分析。但目前还没有利用分子技术探究牡丹杂交亲和性的相关报道。因此，笔者利用SRAP标记技术分析牡丹16个品种的亲缘关系，进而探讨不同杂交组合结实率与亲本亲缘关系之间的联系，为科学选择亲和性高的杂交亲本提供依据。

1材料与方法

1.1试验时间、地点

研究田间试验于2013年在山东农业大学林学试验站进行，室内试验在山东农业大学花卉研究所进行。

1.2试验材料

以牡丹品种‘清香白、‘迎日红、‘朱砂垒、‘黑海撒金、‘凤丹白‘雪莲等16个品种作试验材料，于2013年4月13日采样，均选取幼叶，硅胶干燥后置于4℃冰箱贮存备用，5月中旬在提取DNA并进行测定。

1.3试验方法

1.3.1杂交育种及结实数的统计选择正常生长的植株，每株保留3朵花（大小一致），选上部花，露色后及时去雄套袋。上午8:00—10:00进行人工授粉。选择即将在当日展开的花，拨开花瓣（尽量不损伤花瓣），用镊子轻轻将雄蕊去除，立刻授以干燥的花粉，并套袋挂牌，约1周后子房膨大。8月初当果实变为蟹黄色且微裂时采集，摊放在室内，种子自动脱出，统计种子数量。

1.3.2基因组DNA提取采用CTAB法提取基因组DNA[12]，紫外分光光度计和0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量和浓度，并稀释至25 ng/μL，保存于-20℃备用。

1.3.3SRAP-PCR分析SRAP反应体系参照Li与Quiros[2]，每25 μL的PCR反应体系中，含10×PCR Buffer 2.5 μL，25 mmol/L Mg2+2.0 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2.5 μL，5 U/μL Taq酶0.3 μL，5 μmol/L引物1.5 μL，模板2 μL，ddH2O补充至25 μL。扩增程序为：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，35℃退火1 min，72℃延伸1 min，进行5个循环；94℃变性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸1 min，进行30个循环；72℃延伸10 min，4℃保存。PCR产物采用4%聚丙烯酰胺凝胶储液配制分离，用DG-II暗箱式紫外透箱仪观察拍照。

1.3.4数据分析用ABI377测序仪电泳检测后的片段大小即为原始数据。在原始数据的基础上，有带的地方替换为1，无带的地方替换为0，这样构成了01数据。数据是通过GENESCAN软件进行分析，软件每2个碱基读1次数，Marker片段范围为 70~500 bp，这样在70~500 bp之间一共读取216个数。用POPGENE 1.32和NTSYS-pc version 2.1软件对各材料间的遗传相似系数等进行分析；根据遗传相似系数采用UPGMA法进行聚类分析并构建树状图。

2结果与分析

2.1SRAP扩增产物的多态性

SRAP引物参照苏美和[13]的方法由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司合成，碱基序列见表1，用4份材料对64对SRAP引物进行筛选，共得到9对扩增稳定、条带清晰、多态性好的引物。9对引物从16份材料基因组DNA中扩增处的结果显示，共扩增出1344个位点，其中1330个为多态性位点，占98.95%，平均每对149.3个，多态性位点最多的引物组合为ME5-EM3，达到185个。引物组合ME2-EM2扩增的多态性位点最少为120个。引物对ME5-EM3扩增结果如图1所示。

2.2聚类分析

基于遗传相似系数，利用UPGMA法对16份材料进行聚类分析。在遗传相似系数0.338处，16份供试材料被分为3类。

Ⅰ类仅‘清香白一个品种。它与其他品种亲缘关系较远。形态上花为皇冠型白色，株型高，中型圆叶。

Ⅱ类包括13个品种在遗传相似系数0.364处又分2个亚类：第1亚类包括‘映红和‘朱砂垒。株型均中高，圆叶，花色红色和浅红色，均属红色系。第2亚类包括11个品种，在遗传相似系数0.376处又能分成2组。第1组包括‘藏枝红和‘富贵满堂2个品种。第2组包括‘黑海撒金、‘玉板白、‘富贵红‘等9个株型中、矮品种。

Ⅲ类包括‘三变赛玉和‘凤丹白2个品种。形态上株型均高、直立，长叶，花色为粉白色和白色均属白色系。但两者花型不同，为托桂型和单瓣型。聚类分析图如图2所示。

2.3不同杂交组合与结实率的关系

由表2可知，父本相同的情况下，单瓣型牡丹（如‘凤丹白、‘黑海撒金）的结实数较高，育性好，可获得更多的杂交种子，应多选其做母本；重瓣型牡丹（如‘雪塔）由于雌蕊瓣化严重，育性较差，作母本结实数会低甚至不结实，因此不宜作母本，但其花粉可作父本进行杂交。

根据表2各杂交组合结实数可知，如同是‘清香白作母本，授粉的花朵数相同的情况下，父本是‘雪塔得杂交种子数为23粒，父本是‘富贵满堂得杂交种子数为57粒，父本是‘藏枝红得杂交种子数为15粒。相同母本的不同杂交组合的结实数存在差异，表明父本可能是影响结实数不同的主要因素，结实数因父本品种不同而有所区别。

2.4亲缘关系与结实率的关系

表2中列出了各组合的结实数以及亲本间的相似系数，可见结实数与其相似系数间有着一定的相关。♀‘朱砂垒ב藏枝红♂相似性系数最低为0.3108，但是结实数最高为65粒。♀‘清香白ב富贵满堂♂相似性系数为0.3245，结实数为57粒。相反，♀‘朱砂垒ב雪塔♂相似性系数为0.3958，结实数为11粒。♀‘雪塔ב富贵红♂相似性系数为0.3883，结实率为12粒。所以相似系数较低时，亲缘关系较远，组合的结实数相应较高；相似系数在平均水平时，低于0.35的时候结实数相对较多。而高于0.35时一般呈下降趋势，结实数一般；相似系数更大时，结实率相对较低。但是，当‘彩绘作母本时，结实数受亲缘关系的影响不是很大，可能与其本身育性有关。

3讨论

牡丹栽培品种间杂交基本不存在杂交不亲和的现象，属于近缘杂交[14]。前人的研究和本试验结果都显示，正确的亲本品种选择是提高牡丹亲和性的有效途径[15]。而且亲本之间的亲和性和母本育性共同作用影响了结实数。但是常规的杂交试验分析不能得到具体的亲缘关系数据来说明其对亲和性的影响的不同。笔者得到父母本相似系数在小于0.35时，亲和性增强。从一定程度上反映了牡丹杂交亲缘关系对亲和性影响的规律。

4结论

4.1牡丹杂交育种亲和性的影响因素

对于亲和性的影响，一般母本的影响大于父本。所以母本最好要选单瓣型结实力强，具有符合育种目标性状的品种。根据父本相同，母本不同的杂交组合结实数的分析结果，其结实数的不同可能受母本本身育性的影响。根据母本相同，父本不同的杂交组合结实数的分析结果，父母本间的亲和性应该为影响结种数主要因素。因此，亲本之间的亲和性和母本育性共同作用影响了结实数。而通过SRAP分析结果可知，杂交亲本间的相似系数在0.31~0.35时结实数较高。所以较远的亲缘关系能增强牡丹父母本间亲和性，提高结实率。而且发现‘彩绘为一种优良母本，杂交结实数高。

4.2基于亲和性分析的亲本选择

杂交育种的第一步是性状搭配，但是亲本的亲缘关系也是必须要考虑的[16]。在牡丹杂交育种中，其亲本选择的层次也是如此，首先考虑牡丹杂交育种的一般特性，其次要考虑选中亲本的亲缘关系远近。

通过杂交试验，发现牡丹栽培品种间杂交是比较容易成功的。所以，在实际工作中，可以首先考虑性状的搭配，如花色、株型、叶形、生长势等。但在为了提高亲本间的亲和性从而得到更多的杂交种子，选中的亲本亲缘关系尽量不能过近。由此，可以确定牡丹杂交育种中的亲本选择策略，在考虑到性状搭配的情况下，多以单瓣型牡丹为母本，选择亲缘关系远的品种先杂交。符合性状组合、亲缘关系又不太近的品种也可以选择。

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