大孔树脂对樟子松松塔多酚的纯化工艺研究

刘荣 栾淑莹 方妍等

摘要[目的]优化樟子松松塔多酚纯化工艺，提高松多酚利用率。[方法]以吸附解析率为衡量指标，确定纯化樟子松松塔多酚的最佳树脂；以多酚回收率和纯度为衡量指标，单因素试验研究纯化过程中各因素对纯化效果的影响，并且利用响应面优化樟子松松塔多酚的纯化工艺。[结果]樟子松松塔多酚的初步纯化最适条件为上样液浓度0.2 mg/ml，上样液体积2.10 ml，样液pH 7，径高比1∶25.8，洗脱乙醇浓度57.75%。在此工艺参数下，樟子松松塔多酚的回收率可达68.78%。[结论]经D4020大孔树脂纯化，樟子松松塔多酚纯度由21.6%升至59.4%，说明D4020大孔树脂适宜用于初步纯化樟子松松塔多酚。

关键词樟子松松塔；多酚；纯化；大孔树脂；响应面

中图分类号S791.253文献标识码A文章编号0517-6611（2014）23-07869-04

基金项目国家自然科学基金项目（31170510）。

作者简介刘荣（1971- ），女，黑龙江哈尔滨人，副研究员，博士，硕士生导师，从事食品营養学与功能性食品研究。*通讯作者，教授，博士生导师，从事功能性食品开发研究。

收稿日期20140710多酚类化合物是广泛分布于植物体内的次生代谢产物[1]，是一类具有苯环并结合有多个羟基化学结构的化合物总称，其大量存在于植物中，是许多药用植物的主要活性成分[2]。研究发现松科植物的体内含有大量的多酚类化合物，具有一系列独特的化学性质和生物活性，这类化合物被统称为松多酚。松多酚具有抗肿瘤、抗氧化、降血糖、降血脂、抗动脉硬化、防治冠心病与中风等心脑血管疾病以及抗菌等多种生理功能，在食品、医药、化妆品、日用化学品以及保健品应用等方面起到了一定的作用。目前多酚的提取方法包括有机溶剂浸提[3]、超声波辅助提取[4]和酶法辅助提取[5]等。多酚纯化的方法包括溶剂萃取和柱层析等，其中大孔树脂柱层析因具有较好的吸附和解析效果被广泛应用。该试验使用大孔吸附树脂对樟子松松塔多酚进行纯化，并优化其工艺，以期提高樟子松松塔多酚的利用率，为减少能源消耗、充分开发利用植物多酚资源提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料与仪器樟子松松塔，产地是大兴安岭地区；没食子酸、无水乙醇由天津市东丽区天大化学试剂厂提供；浓盐酸、无水碳酸钠、氢氧化钠、福林酚由天津光复精细化工研究所提供；大孔树脂ADS7、大孔树脂 ADS17、大孔树脂 NKA2、大孔树脂 D4020、大孔树脂 AB8、大孔树脂 D3520由天津海光试剂公司提供。

（FW135）高速万能粉碎机、（DK98IIA）电热恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）；（RE52E）旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；722型可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司）；（DHG9240型）电热恒温鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；JA2003N电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；（Φ1 cm×500 mm）层析柱（天津海光试剂公司）。

1.2研究方法

1.2.1松塔多酚粗提物的制备。将干燥后的樟子松松塔剪成碎片，在粉碎机中粉碎成粉末，过40目筛，得到樟子松松塔多酚粉末。按照乙醇浓度50%，料液比1∶25（g/ml），提取时间4 h，提取温度50 ℃的条件进行水浴提取，提取后抽滤[6]。上清液经旋转蒸发后定容。按照FolinCiocalteu法[7]测定提取液中多酚含量为19.35 mg/ml，纯度为21.6%。

1.2.2大孔树脂的预处理。采用6种不同极性的大孔树脂进行试验，将各种型号大孔树脂置于95%的乙醇中浸泡12 h，充分溶胀后用蒸馏水洗涤，冲洗至无白色浑浊物出现，用5%盐酸浸泡4 h，蒸馏水充分洗涤至中性，再用5%氢氧化钠溶液浸泡4 h，蒸馏水充分洗涤至中性后备用。每次上样洗脱完毕后，先用5%HCl 洗至无色，用蒸馏水洗至pH为中性，再用5%NaOH 洗至无色，最后用蒸馏水洗至pH为中性，方可重复利用。

1.2.3大孔树脂对樟子松松塔多酚吸附剂解吸附性能研究。将预处理后的各种型号大孔树脂各10.0 g，置于100 ml锥形瓶中。向各锥形瓶中分别加入40 ml浓度为2 mg/ml的樟子松松塔多酚样品液。将锥形瓶放置于恒温恒速振荡器中，在25 ℃条件下振荡吸附6 h，在振荡开始后的1、2、3、4、5、6 h时，分别量取1 ml多酚样品液，采用FolinCiocalteu法测定多酚含量，按照式Ⅰ计算吸附率，绘制吸附曲线。随后过滤除去樟子松松塔多酚样品溶液，将各种型号树脂用蒸馏水洗净并置于100 ml锥形瓶中，分别加入40 ml 50 %乙醇置于恒温恒速振荡器中，在25 ℃条件下振荡解析6 h，在解析进行1、2、3、4、5、6 h时，分别量取1 ml溶液，解析后的樟子松松塔多酚解析液，采用FolinCiocalteu法显色后测定吸光值，并计算多酚含量，绘制解析曲线，按照式Ⅱ计算解析率。比较6种大孔树脂对樟子松松塔多酚的吸附率与解析率的影响，确定纯化时可使用的最佳树脂。

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1.2.4静态吸附下样品浓度和pH的适宜工艺条件研究。准确称取6份10.0 g预处理后的大孔树脂于100 ml锥形瓶中，加入浓度为1.0 mg/ml的樟子松松塔多酚样品液40 ml，并分别调节pH至2、3、4、5、6、7，调节pH后加入蒸馏水补齐体积至50 ml。放置于恒温恒速振荡器中，在25 ℃条件下振荡吸附一定时间，量取1 ml樟子松松塔多酚样品液，采用FolinCiocalteu法显色后测定其吸光值，研究pH对大孔树脂吸附樟子松松塔多酚效果的影响。

准确称取6份10.0 g预处理后的大孔树脂于100 ml锥形瓶中，加入浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/ml的樟子松松塔多酚提取物样品液50 ml。放置于恒温恒速振荡器中，在25 ℃条件下振荡吸附一定时间，量取1 ml樟子松松塔多酚样品液，采用FolinCiocalteu法显色后测定其吸光值，研究样品液浓度对大孔树脂吸附多酚效果的影响。

1.2.5动态吸附下纯化工艺条件研究。大孔树脂湿法装柱，向玻璃层析柱中滴加浓度为25 mg/ml的粗提液5 ml，吸附2 h，先用2倍柱体积的蒸馏水清洗，再用50%乙醇溶液洗脱，收集流出液，每5 ml收集1次，测定其中樟子松松塔多酚的浓度（mg/ml），绘制洗脱曲线。收集浓度最大的30 ml，计算多酚回收率（式Ⅲ），并于40 ℃烘干后复溶，测定其多酚含量，计算纯度（式Ⅳ）。

樟子松松塔多酚提取响应面试验因素水平

水平因素A洗脱剂乙醇浓度∥%B上样液体积∥mlC径高比-1401.51∶200502.01∶251602.51∶30

利用Design expert 6.0.5软件进行响应面优化试验设计，以多酚回收率为响应值，确定最佳的纯化条件，并根据结果进行验证试验[8]。

2结果与分析

2.1大孔树脂的筛选所用的6种树脂的物理特性见。这6种大孔树脂对于樟子松松塔多酚的吸附率和解析率的结果见。由可以看出，NKA2、ADS7、D3520这3种树脂对多酚的吸附率可高达71.55%、71.65%、72.34%，但是其解析率仅为38.24%、34.94%、35.60%，而D4020树脂吸附率和解析率都高于其他5种树脂，所以D4020树脂是纯化樟子松松塔多酚的理想树脂。

6种大孔树脂理化性质

树脂种类比表面积∥m2/g平均孔径∥nm极/非极性NKA-2160～20014.5～15.5极性ADS-790～150200极性ADS-1790～15025～30中等极性AB-8480～52013～14弱极性D3520480～52085～90非极性D4020540～580100～105非极性

6种大孔树脂对樟子松松塔多酚的吸附率和解析率的影响2.2D4020大孔树脂静态吸附条件的研究

2.2.1上样液浓度对树脂吸附率、解析率的影响。樟子松松塔多酚粗提物上样液浓度对D4020树脂吸附率、解析率的影响如所示。随着粗提物浓度的增加，树脂吸附率下降，其原因可能是随样品浓度增大，树脂间的孔隙被填满，达到饱和状态。树脂解析率在粗提物浓度为0.2 mg/ml时达到最大值，之后呈下降趋势。综合考虑，采用上样液浓度0.2 mg/ml进行后续试验。

上样液浓度对D4020树脂吸附率和解析率的影响2.2.2上样液pH对树脂吸附率、解析率的影响。如所示，D4020树脂对樟子松松塔多酚的吸附率与解析率在pH为7时达到最大值，而最初的樟子松松塔多酚提取液pH就在7左右，所以试验最适的上样液pH为7，后续试验无需调节上样液pH。

上样液pH对D4020树脂吸附率和解析率的影响2.3D4020大孔树脂动态吸附条件的研究

2.3.1洗脱曲线的绘制。选取2 ml浓度为2 mg/ml的提取液充分吸附后用50%乙醇洗脱，每5 ml收集1管，测定其中多酚的浓度，绘制动态洗脱曲线。由可以看出，从第2管开始，洗脱液中多酚含量显著增加，当洗脱至第4管时洗脱液中多酚含量达到最大值，从第6管之后随着洗脱体积的增加，多酚含量逐渐下降，所以该试验收集2～6管的30 ml樟子松松塔多酚溶液进行后续试验。

樟子松松塔多酚动态洗脱曲线2.3.2上样液体积对松塔多酚回收率、纯度的影响。由可知，随着上样液体积的增加，樟子松松塔多酚纯度呈先上升后下降的趋势，在上样液体积为3 ml时达到最高。呈现这一趋势的原因可能是随着上样液体积的增加，大孔树脂对多酚的吸附量增加，但是上样液体积过大，与松多酚竞争吸附的杂质也相应增多，导致松多酚在树脂内部的扩散能力降低[9]。随着上样液体积的增加，松多酚回收率也呈先上升后缓慢下降的趋势，在上样液体积为2 ml时达到最大值。由于纯度变化程度比回收率变化程度小，综合考虑上样液体积确定为2 ml。

上样液體积对松塔多酚回收率及纯度的影响2.3.3径高比对松塔多酚回收率、纯度的影响。由可知，随着径高比的增加，松塔多酚的纯度变化不明显。随着径高比的增加，松塔多酚的回收率先呈上升趋势，在径高比为1∶25时达到最高，之后随径高比增加呈下降趋势，在径高比为1∶35时又呈上升趋势，但是径高比过大，会导致松塔多酚在大孔树脂内的扩散路径增加，造成大孔树脂的浪费，同时增加了松多酚的损失。综合考虑其影响，确定径高比为1∶25。

42卷23期刘 荣等大孔树脂对樟子松松塔多酚的纯化工艺研究径高比对松塔多酚的回收率及纯度的影响2.3.4洗脱剂乙醇浓度对松塔多酚回收率、纯度的影响。由可知，随洗脱剂乙醇浓度的增加，松塔多酚纯度先呈缓慢上升趋势，在洗脱剂乙醇浓度为50%时达到最高，之后随洗脱剂乙醇浓度增加呈下降趋势。这可能是由于在一定范围内，乙醇浓度增加，松塔多酚的溶解性也不断增加，因而纯度提高，但由于樟子松松塔多酚既含醇溶性成分，又含有水溶性成分，过高的乙醇浓度导致水溶性多酚溶解性降低，同时高浓度的醇溶液会导致醇溶性杂质被溶解出来，因此纯度会有所下降。随着洗脱剂乙醇浓度的增加，松塔多酚回收率也呈先上升再下降的趋势。综合考虑对松塔多酚纯度和回收率的影响，洗脱剂乙醇浓度确定为50%。

采用响应面法软件对试验结果进行方差分析，其结果见。模型误差P=0.008 4，差异显著；失拟项P=0.139 8>0.05，差异不显著，说明了方程对试验拟合的情况好，试验误差小；变异系数值为2.02，接近于1，说明试验可靠性高；模型的校正决定系数 R2adj=0.875 4，说明该模型能解释87.54%响应值的变化，仅有总变异大约12.46%不能用此模型来解释。

洗脱液乙醇浓度的一次项、径高比一次项对纯度的影响显著；径高比的二次项的影响为极显著；洗脱液浓度的二次项、上样液体积的二次项、上样液体积和径高比的交互项，洗脱液浓度和上样液体积的交互项，洗脱液浓度和径高比的交互项的影响不显著。通过F值还能看出，试验中各因素对樟子松松塔多酚回收率的影响大小顺序为径高比、洗脱液浓度、上样液体积。

洗脱液浓度、径高比对樟子松松塔多酚回收率影响的响应面从樟子松松塔多酚回收率与径高比、洗脱液浓度曲面图可以看出，最优点趋近于径高比1∶26、洗脱液乙醇浓度60%时，回收率在这2点附近达到最大值。从樟子松松塔多酚与上样液体积、径高比曲面图可以看出，最优点趋近于上样液体积2.10 ml和径高比1∶25.5，回收率在这2点附近达到最大值。从樟子松松塔多酚与洗脱液浓度、上样液体积曲面图（0）可以看出，最优点趋近于洗脱液浓度58%，上样液体积2.10 ml时，回收率在这2点附近达到最大值。经分析优化后，最终确定松多酚初级纯化最优提取条件为洗脱剂乙醇浓度57.75%、上样液浓度0.2 mg/ml、上样液体积2.10 ml、径高比1∶25.8，经优化后樟子松松塔多酚回收率可达68.78%，纯度可达59.4%。

2.5响应面优化验证试验对试验进行放大处理，采用柱体积为370 ml，上样液体积15.5 ml，洗脱液浓度57.70%，上样液浓度0.2 mg/ml，径高比1∶25.8这些提取条件，选取浓度最大的6段样液进行混合，测其吸光值，计算得回收率为68.59%。