天七方对H2O2诱导心肌细胞损伤的抗氧化作用研究

刘松涛等

【摘要】目的：研究天七方（TQ）对H2O2所致心肌细胞损伤的抗氧化作用。方法：建立H2O2诱导的心肌损伤模型，通过MTT法观察在不同浓度天七方的干预下，对心肌细胞增殖作用的影响，采用试剂盒法检测丙二醛（MDA）含量，超氧化物歧化（SOD），谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和过氧化氢酶（CAT）活力。结果：天七方可明显抑制H2O2诱导的心肌细胞的凋亡，降低MDA水平，提高SOD，GSH-Px和CAT的活力。结论：天七方通过提高抗氧化酶的活力，抑制H2O2所致的心肌细胞的氧化损伤。

【关键词】天七方；心肌损伤；氧化应激

【中图分类号】 Q554 【文献标识码】B【文章编号】1004-4949（2014）03-0077-01

随着人们生活水平的不断提高，人口平均寿命的延长，缺血性心脏病（又称冠心病，coronary artery disease，CAD）的发病率不断上升，已经成为当今世界威胁人类健康的主要疾病之一。越来越多的研究显示，氧化应激在缺血性心脏病的发生发展过程中扮演了重要的角色，是引起心肌细胞凋亡的主要影响因素之一[1]。氧化应激是指活性氧自由基的产生超过了机体内的清除和/或使用能力，而导致活性氧自由基及其相关代谢产物在体内的过量聚集，从而对机体造成多种损害作用的病理状态[2]。

中药复方天七方由红景天，三七，柴胡和太子参组成，是黑龙江省著名老中医刘勤教授运用中医理论，结合几十年的临床经验精心研制并总结出的治疗冠心病，心肌缺血的经验方。本文从分子水平深入阐明天七方抗心肌缺血的作用机制，为其临床的应用和推广提供坚实的理论基础。

1 材料与方法

1.1动物 SPF级SD♂乳鼠（24 h），由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。

1.2药物 红景天、三七、柴胡和太子参，各药物加水浸泡30 min，先加药量8倍的水，沸腾后煎40 min，过滤取汁，再加8倍的水，沸腾后煎30 min，合并两次滤液浓缩并减压干燥，研制成粉末。

1.3试剂 DMEM细胞培养基（Invitrogen，美国），标准胎牛血清（Gibco，美国），0.25%胰酶消化液（Hyclone，美国），双抗（Penicillin-Streptomycin Solution，Hyclone，美国）。H2O2（北京化工厂），二甲基亚砜（DMSO，Sigma，美国）。MDA，SOD，GSH-Px和CAT检测试剂（南京建成生物工程研究所）。

1.4仪器 荧光正置显微镜DM4000B（Leica，德国），二氧化碳细胞培养箱Heraeus BB15（Thermo Scientific，美国），超净工作台ZHJH-C1115B（上海智成分析仪器制造有限公司），立式压力蒸汽灭菌器（江阴滨江医疗设备有限公司），微孔板扫描酶标仪（BioTek insrument，美国），低温离心机Labofuge 400R（Thermo Electron，德国）。

2实验方法

2.1 心肌细胞的分离与培养

新生大鼠75%酒精消毒皮肤，迅速开胸，无菌条件下取心室肌，放入PBS液中清洗2～3次，放入无血清的DMEM培养液中，剪成1～1.5 mm3的碎块，移入离心管中，1000 r·min-1离心3 min，弃上清，加入0.08%的胰酶置于37℃水浴中，消化6～7次，每次消化10 min。前两次弃上清，从第3次起收集心肌细胞，过200目筛，1000 r·min-1离心5 min后加入含15%胎牛血清的DMEM培养液制成细胞悬液，在CO2培养箱中培养2 h，以差速分离法去除已贴壁的成纤维细胞，取上清液计数并稀释细胞密度为1×105个·L-1。接种于96孔板，每孔100 μl，于37℃、CO2培养箱中静置贴壁培养。每24 h更换1次培养液，48 h后选生长状态良好的心肌细胞分组处理，进行实验。

2.2 细胞存活率测定

96孔板接种细胞，单层融合后，每孔加入100μl MTT （1g·L-1 ），置于37℃、5%CO2孵箱中孵育4 h，取出后吸弃培养液，每孔加入100μl DMSO，微样振荡器震荡10 min，于酶标仪570 nm处读取吸光度值，计算细胞存活率。细胞存活率/% = 各组吸光度值（A） /空白组吸光度值（A） × 100%

2.3 天七方对正常乳鼠心肌细胞的影响

取接种于96孔板培养48 h后的心肌细胞，弃除原培养液，用PBS液洗两次。正常组每孔加入不含FBS的DEMA培养液100 μl，给药组每孔加入含天七方终浓度分别为5、10、20 mg·L-1的不含FBS的DEMA培養液100 μl，在孵箱中继续培养24 h后，MTT法检测细胞存活率。

2.4 H2O2诱导的心肌细胞损伤模型的建立

取接种于96孔板培养48 h后的心肌细胞，吸弃原培养液，用PBS液洗两次。正常组每孔加入不含FBS的DMEM培养液100 μl；模型组每孔加入H2O2终浓度分别为50、100、200、400和800μmol·L-1不含FBS的DMEM培养液100 μl，在孵箱中继续培养5 h后，采用MTT法检测细胞抑制率。确定建立H2O2损伤模型的最适条件。

2.5 天七方对H2O2损伤心肌细胞保护作用的量效关系研究

取接种于96孔板培养48 h后的心肌细胞，将细胞分成正常组、模型组和天七方组（5、10和20 mg·L-1）。正常对照组每孔加100 μl无血清培养基；模型组，每孔加入不含FBS、含H2O2的DEMA培养液100 μl，终浓度为200 μmol·L-1，放入CO2孵箱，37℃培养；天七方组5、10和20 mg·L-1各剂量组分别预孵4 h后，弃上清，加100μl的200 μmol·L-1H2O2作用5 h后，MTT法检测细胞存活率。细胞存活率/% = 各组吸光度值（A）/空白组吸光度值（A）×100%。

2.6 天七方对H2O2诱导的心肌细胞损伤中CAT、SOD、和GSH-Px活力和MDA含量的影响

各组处理同“1.3.5”，在6孔板中，消化收集各组细胞，每组加1 ml PBS使细胞重悬，采取反复冻融的方法（-80℃冰箱15 min，室温20 min，如此重复5次）裂解细胞，进行BCA定量，然后按照试剂盒说明书对细胞裂解液进行SOD、CAT、GSH-Px活力及MDA含量的测定。

2.8 统计学分析

实验数据以X±s表示，各组间均数比较采用单因素方差分析，两样本比较采用配对t检验。

3 结果

3.1 天七方单独给药对心肌细胞的影响

结果显示，天七方各剂量组（5、10和20 mg·L-1）预孵育24 h，与空白组相比，对正常心肌细胞无明显损伤（p>0.05）。结果如Fig. 1所示。

4讨论

在过去的几十年里，缺血性心脏病的发病率和死亡率呈逐渐上升的趋势。而由于缺血性心脏病的高危因素如糖尿病、肥胖和吸烟等的普遍流行以及老龄人口的增多更可预示未来缺血性心脏病对人类健康的威胁[3]。虽然目前对于缺血性心脏病的治疗如药物治疗及冠脉介入治疗等取得了较好的疗效，但仍存在一定的问题[4]。药物治疗易产生不良反应，介入治疗可导致继发性损伤，而传统中药因其临床有效性和其可靠的安全性而逐渐得到世界范围内医学工作者的认可。

氧化应激诱导的心肌细胞凋亡在缺血性心脏病的发生发展过程中发挥了重要作用[5]。心肌细胞内活性氧自由基在细胞内的异常增多可导致生物大分子的损伤性修饰，而最终通过不同信号途径导致心肌细胞凋亡性死亡的发生[6-7]。由于心肌细胞是终末分化的细胞，不具备增殖能力，因此心肌细胞的凋亡导致心肌细胞大量丢失，而严重影响病人的预后。因此，氧化应激诱导心肌细胞凋亡是缺血性心脏病治疗的重要靶点之一。

天七方是临床应用证实有效的经验方，由红景天，三七，柴胡和太子参四味中药组成。在此方中，红景天可活血、通脉止痛，三七止血散瘀、消肿止痛，而柴胡和太子参有疏散益气的功效。在本研究中，H2O2处理显著增加细胞凋亡性死亡发生的比例，而天七方对H2O2引起的乳鼠心肌细胞凋亡具有明显的保护作用。

细胞凋亡又称程序性细胞死亡（Programmed cell death），是在完整的细胞膜内经一系列蛋白酶和核酸酶调节的主动的死亡方式。氧化应激通常是指ROS产生和清除的不平衡导致的ROS在细胞内的过量聚集，其可诱导细胞凋亡[8]。细胞具有一套内源性的抗氧化酶类物质用于对抗ROS的可能的损伤作用，其中包括超氧化物歧化酶（SOD），过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）。研究显示提高抗氧化酶的活性可对不同形式的氧化性损伤具有保护作用。本实验研究结果表明与空白组相比H2O2明显抑制SOD、CAT和GSH-Px酶活性，导致细胞内ROS不能被及时清除。天七方预处理可明顯增加SOD、CAT和GSH-Px酶活性，提示天七方保护心肌细胞的作用机制是抗氧化作用，这与以往报道的红景天在缺氧/复氧模型中保护心肌组织中SOD活性，降低MDA含量的结果相一致[9]。此结果说明天七方可能通过增强机体清除氧自由基的能力，减少氧自由基、羟自由基的生成、抑制脂质过氧化从而抑制心肌损伤，这可能是天七方抗氧化应激的重要机制之一。

参考文献

[2] Pryor WA， Houk KN， Foote CS， et al. Free radical biology and medicine： Its a gas， man！ [J]. Am J Physiol， 2006， 291： R491-511.

[3] Kim NH， Kang PM. Apoptosis in cardiovascular diseases： Mechanism and clinical implications [J]. Korean Circ J， 2010， 40： 299-305.

[5] Lefer DJ and Granger DN. Oxidative stress and cardiac disease [J]. Am J Med， 2000， 109： 315-23.

[6] Ott M， Gogvadze V， Orrenius S， et al. Mitochondria， oxidative stress and cell death [J]. Apoptosis， 2007， 12： 913-22.

[9] 朱宁，张喆，刘莉，陈彦红，邸雪琴. 红景天苷对缺氧诱导培养乳鼠心肌细胞的保护作用[J]. 中成药， 2012， 34（8）：1587-1589.