远端缺血预处理对血清miRNA表达水平的影响及对心肌保护作用的研究

郑浩　陈菲菲　王珏

[摘要] 目的 观察远端缺血预处理对血清miRNA的表达水平的影响及对心肌的保护作用。 方法 选择2012年7月～2013年12月本院收治的合并心力衰竭的瓣膜病患者60例，随机分为对照组和观察组，各30例。两组患者入院后行相关评估，麻醉诱导后，观察组患者行远端缺血预处理，对照组同样放置压力带，但不进行充气，后建立体外循环并行手术。检测患者手术前、手术24 h后患者血清肌钙蛋白I（cTnI）、脑钠素（BNP）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）的变化；采用实时定量荧光PCR（qRT-PCR）来测定miRNA的表达；观察两组患者术后呼吸机使用时间、ICU停留时间，并采用超声心动图监测手术后7 d左心室射血分数（LVEF）；记录两组患者术后心律失常评分及自动复跳率。 结果 手术24 h后，两组患者生化指标较手术前均有所升高，但观察组升高程度不及对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；手术24 h后，两组患者miRNA表达水平较手术前均有所升高，观察组miRNA-1升高程度不及对照组，miRNA-21、miRNA133a升高程度大于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）；观察组患者心律失常评分均小于对照组，手术中心脏复跳后LVEF及自动复跳率均高于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。结论 远端缺血处理可减少再灌注后心肌损伤，产生一定的心肌保护作用，并有可能通过抑制miRNA-1的表达、促进miRNA-133、miRNA-21的表达来发挥作用。

[关键词] 远端缺血处理；miRNA；心肌损伤；再灌注；心律失常

[中图分类号] R363 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2016）30-0005-04

体外循环技术使心脏手术成为可能，但其同时会造成心肌细胞的缺血、缺血及再灌注损伤，进而引起心肌细胞凋亡，损伤心功能[1]。为改善体外循环过程中对心肌保护，部分药物被用来减少心肌细胞的缺血再灌注损伤，但迄今为止尚无明确的方法来改善体外循环的心肌保護过程[2]。缺血预处理（ischemic preconditioning，IPC）是一项内源性的适应性反应保护策略，它是通过简短交替实行缺血/再灌注，以提高随后缺血损伤的抵抗能力[3]。“处理”后的患者心脏可以更长时间的耐受缺血再灌注所产生的损伤，已在临床证实为一种有效的内源性心肌保护策略。随后发现在远离心脏的组织及器官进行缺血预处理亦能产生同样的心肌保护作用，将其称为远端预处理（remote ischemic preconditioning，RIPC）[4]，而microRNA[5]是一类长度在20～23个核苷酸片段的非编码小RNA分子，具有负性调节基因的作用，本研究旨在观察远端缺血预处理对瓣膜性心脏病患者血清中miRNA表达水平及心肌保护作用的影响，为临床治疗提供依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本研究经医院医学伦理委员会批准。选择2012年7月～2013年12月本院收治的合并心力衰竭的瓣膜病患者60例，患者均完善术前检查及准备，进行心功能及运动耐量评估。心功能评价依靠MRI和超声心动图检测，固定MRI操作医生和超声心动图操作医生；运动耐量应用6 min步行试验。患者知晓本实验研究，签署知情同意。纳入标准[6]：患者为瓣膜性心脏病，符合美国2006年瓣膜性心脏病指南的Ⅰ类和Ⅱa类适应证；严重左室功能低下，MRI显示左室EF≤30%，超声心动图显示左室EF≤40%；既往无频发室性心律失常，或存在恶性室性心律失常病史；患者无认知障碍，依从性佳，可配合治疗以及参与系列功能检查，愿意参加术后随访。排除标准：3个月内出现急性心梗；合并恶性肿瘤，合并血液系统疾病，血液检查异常：白细胞计数≤4 000/μL或≥10 000/μL，血红蛋白≤10 g/dL，血小板计数≤100 000/μL；或凝血功能异常；不能进行MRI检查；1年内参加其他药物的临床试验；严重肝肾疾病[AST（GOT）>100 IU/L，或ALT（GPT）>100 IU/L]，不能耐受试验；孕妇或处于哺乳期；即往有严重的过敏反应病史；具有其他不适合临床试验的情况。将60例患者分为对照组和观察组，每组30例。两组患者年龄、性别、病程、瓣膜病变类型等一般资料比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。见表1。

1.2 方法

1.2.1 麻醉方式 采用维库溴铵、咪达唑仑诱导，行气管插管，中心静脉及桡动脉分别置管，连续监测患者生命指征及动脉血压，同时监测体温。手术时给予异丙酚，速度维持在（4～6）μg/（kg·h），间断给予芬太尼，速度维持在（8～10）μg/（kg·h），同时吸入七氟醚。

1.2.2 远端缺血预处理方法[7] 麻醉诱导后，将患者左侧上臂进行远端缺血预处理，用特用压力袖带包绕左上臂，每次5 min，共重复3次，压力200 mmHg。检测指尖氧饱和度下降到80%以下为阳性。5 min间期进行再灌注。对照组同样放置压力带，但不进行充气，共30 min。患者及手术医生进行双盲操作。

1.2.3 体外循环的建立及手术[8] 采用正中胸骨切口，于升主动脉远端插入灌注管，上下腔静脉分别插腔静脉引流管，单纯主动脉瓣置换插房腔管，右上肺静脉置管行左心引流，建立体外循环。两组患者均在常规浅低温、中度稀释体外循环下行心内直视瓣膜置换手术，采用冷晶心肌保护液顺灌保护心肌。体外循环：采用常规预充复方氯化钠500 mL，羟乙基淀粉或號拍酷明胶1000 mL，甘露醇200 mL，肝素30 mg，硫酸镁1 g。可采用速尿维持晶胶比范围在0.6～0.7，必要时使用浓缩红细胞或血浆维持术中红细胞比容为0.20～0.25。术中抗凝使用肝素。心脏停跳期间维持体温31℃。灌注流量维持（2.2～2.6）L/（min·m2）体表面积。阻断升主动脉后，采用1∶4冷晶-血液20 mL/kg，以250 mL/min的速度从主动脉根部灌注，每隔半个小时用1∶8冷晶-血液10 mL/kg复灌。全部手术均由相同的手术医师完成。

1.3评价指标[9，10]

（1）采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测患者手术前、手术24 h后的血清肌钙蛋白I（cTnI）、脑钠素（BNP）、肌酸激酶同工酶 （CK-MB）的变化。（2）前期研究已采用miRNA芯片检测RIPC后患者血清miRNA表达谱改变，获得变化倍数大于2倍可能参与远端缺血预处理的miRNA（miRNA-1、miRNA-21、miRNA133a），采用实时定量荧光PCR（qRT-PCR）来测定上述miRNA的表达，检测过程按照上海康成公司提供试剂盒说明来进行。（3）采用超声心动图仪器监测两组患者手术中心脏复跳后左心室射血分数（LVEF）。（4）记录两组患者术后心律失常评分及自动复跳例数，参照 Curtis-Walker标准[4]评价术后患者心律失常评分，标准如下：未出现心律失常计0分；房性心律失常，偶发室早计1分；室早二联律、三联律、频发室早、二度房室传导阻滞计2分；短阵室速，多源室早计3分；室速，三度房室传导阻滞计4分；室颤计5分。自动复跳率=自动复跳例数/总人数×100%。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0版统计学软件包进行数据处理。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，比较进行t检验。计数资料以百分比表示，比较进行χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者手术前及手术后24 h心肌坏死标志物的比较

手术前，两组患者cTnI、BNP、CK-MB比较无明显差异（P>0.05），手术24 h后，两组患者上述指标较手术前均有所升高，但观察组升高程度不及对照组，差异有统计学意义（P<0.05），见表2。

2.2 两组患者手术前后miRNA-1、miRNA-21、miRNA133a的检测表达比较

手术前，两组患者miRNA-1、miRNA-21、miRNA133a比较差异无统计学意义（P>0.05），手术24 h后，两组患者上述指标较手术前均有所升高，观察组miRNA-1升高程度不及对照组，miRNA-21、miRNA133a升高程度大于对照组，差异有统计学意义（P<0.05），见表3。

2.3 两组患者手术中心脏复跳后LVEF、心律失常评分及自动复跳率比较

观察组患者心律失常评分均小于对照组，手术中心脏复跳后LVEF及自动复跳率均高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05），见表4。

3 讨论

远端缺血预处理（RIPC）是一种无创性[11，12]的由机体自身启动内源性的保护机制，能对机体器官的缺血再灌注损伤进行保护。对该过程的机制研究有助于心肌缺血再灌注损伤及其他器官如脑、肝脏等器官的缺血再灌注损伤的保护，并且对于器官移植过程中造成的缺血再灌注损伤也有一定的作用。近年来，越来越多研究显示[13，14]远程预处理无论应用在心脏或心脏外其他器官均能减少再灌注损伤，且通过非心脏的其他器官（如肾、肝或肠）或组织（上下肢骨骼肌）的缺血预处理来保护远处的心肌缺血损伤。远程心脏保护作用也可以不通过缺血刺激，而是通过远膈器官如肢体的缺血刺激、局部使用辣椒素和非创伤外周伤害性切口来实现心脏保护作用。RIPC的机制[15，16]：主要由三部分组成。远端组织激活或产生促动子、远端组织和心脏之间的交流、心肌内保护现象的诱导[17]。当前研究多将其机制与缺血预处理的研究机制联系在一起。譬如，包括腺苷、缓激肽、鸦片体被认为是可能的远端启动子。但是，至今尚未找到明确的作用机制。近期，研究人员在一些模型实验中发现RIPC可能包括某种未明确的“小的疏水分子”的血源性体液因子参与反应[18]。

现今发现miRNAs几乎能够调控所有心脏病理生理过程，包括心脏重塑，发育，纤维化过程，以及细胞凋亡，血管新生，心肌收缩力和心脏电生理[19]，相关心肌梗死后的miRNA调控也有较多报道，多集中于调控心梗后心肌凋亡，缺血再灌注损伤。同一个miRNA一般能够作用于成百个不同的靶点mRNAs，这些靶点在一定程度上部分关联，从而使miRNA能够在调控网络上游整体调控比较复杂的病理过程或疾病状态。miRNA-1[16]具有心肌和骨骼肌的表达特异性，可负性调控靶基因HSP70蛋白的表达，而许多研究发现HSP70蛋白可以减轻缺血-再灌注损伤，从而对心肌产生保护作用，而miRNA-133同样在心脏和骨骼肌的肌细胞中特异性表达，在心脏中的miRNA-133其表达可受到心脏转录因子SRF的调控，并对SRF具有负反馈作用。与miRNA-1相反的是miRNA-133可促进心肌原细胞的增殖，并抑制细胞分化，从而起到保护心肌的作用。而miRNA-21可以调控PDCD4基因的转录，并借此减少心肌梗死的发生率，抑制心肌细胞凋亡[20]。

本研究结果显示，RIPC处理后患者较对照组患者心脏损伤更小，且发生心律失常可能性更低，自主复跳率更高，而术后miRNA-1、miRNA133a、miRNA-21均升高，但較对照组miRNA-1有所减低，miRNA133a、miRNA-21有所升高，与前期研究结果吻合。

综上所述，远端缺血处理可减少再灌注后心肌损伤，产生一定的心肌保护作用，并有可能是通过抑制miRNA-1的表达，促进miRNA-133、miRNA-21的表达来发挥作用。

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（收稿日期：2016-06-12）