HIV感染者外周浅表淋巴结中CD4+T淋巴细胞计数与胶原沉积的关系研究

黄磊，许文，卢祥婵，邓建宁，陈威巍，聂为民，秦恩强，赵敏，周先志

·论著·

HIV感染者外周浅表淋巴结中CD4+T淋巴细胞计数与胶原沉积的关系研究

黄磊，许文，卢祥婵，邓建宁，陈威巍，聂为民，秦恩强，赵敏，周先志

目的通过对不同感染阶段HIV感染者外周浅表淋巴结中CD4+T淋巴细胞、胶原蛋白、白细胞介素（interleukin, IL）-7的检测，以及CD4+T淋巴细胞计数与胶原沉积的相关性分析，探讨HIV感染后胶原沉积对CD4+T淋巴细胞的影响。方法选择HIV感染者43例，分为HIV感染无症状组和AIDS组，留取外周浅表淋巴结活体组织检查（活检）组织；另外选择非HIV感染者12名为健康对照组，同样留取其外周浅表淋巴结活检组织。利用免疫组织化学方法检测研究对象淋巴结中CD4+T淋巴细胞、Ⅰ型胶原蛋白和IL-7定量及分布情况。结果①随着病程进展，HIV感染者外周浅表淋巴结中胶原沉积逐渐增加，AIDS组高于无症状组，无症状组高于健康对照组，差异均有统计学意义（P均＜0.05）；②HIV感染无症状组外周浅表淋巴结中CD4+T淋巴细胞计数与健康对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05），而AIDS组则显著减少（P＜0.01）；③HIV感染者外周浅表淋巴结中CD4+T淋巴细胞计数与胶原沉积量呈负相关（R2=0.724，P=0.000），与外周血中CD4+T淋巴细胞计数呈正相关（R2=0.702，P=0.000）；④3组IL-7的表达水平差异无统计学意义（P＞0.05），而AIDS组部分患者淋巴结中IL-7呈局部聚集性分泌。结论HIV感染后外周浅表淋巴结中胶原沉积逐渐增加导致结构破坏，可能是CD4+T淋巴细胞进行性减少的一个重要原因，虽然IL-7有随病程进展而分泌增加的趋势，但仍不足以弥补淋巴结结构破坏对CD4+T淋巴细胞的影响。

HIV；获得性免疫缺陷综合征；胶原蛋白；CD4+T淋巴细胞；白细胞介素-7

CD4+T淋巴细胞的减少是HIV致病的中心环节和病程进展的重要标志[1-2]。HIV通过多种机制导致感染者CD4+T淋巴细胞减少，例如：HIV对CD4+T淋巴细胞的直接杀伤作用；HIV感染后因免疫系统损伤导致的广泛免疫激活；HIV感染导致胸腺功能受抑，致使CD4+T淋巴细胞生成不足。淋巴结是CD4+T淋巴细胞定居的主要部位之一，也是HIV感染重要场所，HIV在淋巴结中反复感染，导致淋巴结内持续炎症状态，进而引起其结构破坏。由于淋巴结是淋巴细胞发育、分化、成熟的重要免疫器官，其正常结构对于维持CD4+T淋巴细胞的正常循环、生存及功能至关重要[3]。本研究拟通过对HIV感染者外周浅表淋巴结中胶原蛋白沉积、CD4+T淋巴细胞计数及白细胞介素（interleukin,IL）-7分泌的观察，探讨HIV感染后淋巴结结构改变对CD4+T淋巴细胞的影响，以期为AIDS发病机制的研究提供依据。

1 对象与方法

1.1 对象选取2009—2013年在解放军第三〇二医院和南宁市第四人民医院就诊且有外周浅表淋巴结肿大的HIV感染者43例，年龄26～58（40.17± 10.23）岁。其中30例因异性不洁性行为感染，6例因同性不洁性行为感染，5例因不洁静脉注射感染，2例感染途径不详。患者签订知情同意书后，常规手术留取外周浅表淋巴结活体组织检查（活检）组织（颈部24例，腋窝17例，腹股沟2例）。根据《艾滋病诊疗指南（2011版）》[4]，将感染者分为HIV感染无症状组（11例）和AIDS组（32例）。其中，24例在手术当天留取外周血检测CD4+T淋巴细胞计数。另外选择12名非HIV感染者为健康对照组，留取其外周浅表淋巴结活检组织，病理诊断均为反应性增生。

1.2 主要仪器和试剂采用美国BD公司（FACS Calibur型）流式细胞仪对HIV感染者全血样本CD4+T淋巴细胞计数进行测定。流式CD3/CD4/ CD8抗体购自美国BD公司，免疫组化鼠抗人Ⅰ型胶原蛋白单克隆抗体、鼠抗人CD4单克隆抗体和兔抗人IL-7单克隆抗体均购自英国Abcam公司。

1.3 全血CD4+T淋巴细胞计数测定取50μl抗凝血加入绝对计数管（TruCOUNT Tubes）中，加入10μlCD3/CD4/CD8抗体，室温避光染色20min。加入10倍稀释的溶血素（FACSLysing Solution）450μl，混匀避光15min，上机检测。

1.4 免疫组织化学采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶法（SP法）。手术摘取淋巴结后，以4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，4μm切片，切片常规脱蜡至水。CD4、IL-7抗体染色切片，置入pH值8.0 EDTA溶液中，微波抗原修复；Ⅰ型胶原蛋白抗体染色切片，以胰蛋白酶消化。随后0.3%～3.0% H2O2-甲醇溶液去除内源过氧化物酶，血清封闭后分别加入相应抗体，4℃过夜，加相应二抗孵育，以AEC显色，阳性为红色。以HIV感染者淋巴结加PBS替代抗体组和非HIV感染者淋巴结加抗体组作为阴性对照。

1.5 图像分析在20倍光学显微镜下观察。CD4抗体染色每张切片任取10个视野，对每个视野内淋巴结中CD4+T淋巴细胞计数，取平均值。利用LEICA Qwin图像分析系统对胶原蛋白或IL-7抗体染色的每张切片任意10个视野进行灰度分析，检测胶原蛋白和IL-7在淋巴结中表达的灰度值。

1.6 统计学处理用CHISS 2004软件对数据进行统计分析。定量资料呈正态分布，用±s表示，指标在3组间比较用单因素方差分析（组间数据方差齐），两两比较用q检验。HIV感染者外周浅表淋巴结中CD4+T淋巴细胞计数与外周血CD4+T淋巴细胞计数的相关性分析用pearson相关分析和直线回归分析。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

表1 3组外周浅表淋巴结中胶原蛋白沉积量比较（±s，灰度)Table 1 Com parison of collagen deposition in peripheral superficial lym ph nodes among the three groups（±s,grey scale)

表1 3组外周浅表淋巴结中胶原蛋白沉积量比较（±s，灰度)Table 1 Com parison of collagen deposition in peripheral superficial lym ph nodes among the three groups（±s,grey scale)

注：两两比较，AIDS组vs无症状组，P=0.000；AIDS组vs健康对照组，P=0.000；无症状组vs健康对照组，P=0.035

项目n胶原蛋白AIDS组3260.293±9.982无症状组1135.886±15.708健康对照组1224.303±8.139 F值54.515 P值0.000

图1 HIV感染者外周浅表淋巴结中Ⅰ型胶原蛋白沉积情况Figure 1 TypeⅠcollagen deposition in peripheral superficial lym ph nodes of HIV-infected individuals

2.1 HIV感染者外周浅表淋巴结中胶原蛋白沉积情况HIV感染后，外周浅表淋巴结中Ⅰ型胶原蛋白沉积逐渐增加。AIDS组高于无症状组，无症状组高于健康对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）（表1、图1）。病理评估显示，在无症状组中，6例淋巴结内可见增生淋巴滤泡，2例未见淋巴滤泡；而AIDS组中则很难看到淋巴滤泡，在所有32例中仅7例可见到萎缩淋巴滤泡，部分患者淋巴细胞极度减少，代之以大量的沉积胶原。

2.2 HIV感染者外周浅表淋巴结中CD4+T淋巴细胞计数与健康对照组相比，无症状组外周浅表淋巴结中CD4+T淋巴细胞计数差异无统计学意义（P＞0.05），而AIDS组显著减少（P＜0.01）。AIDS组较无症状组亦显著减少（P＜0.01）（表2、图2）。

表2 3组外周浅表淋巴结中CD4+T淋巴细胞计数比较（±s，个/200倍视野)Table 2 Comparison of CD4+T lymphocyte count in peripheral superficial lym ph nodes among the three groups (±s,cells/200 times visual field)

表2 3组外周浅表淋巴结中CD4+T淋巴细胞计数比较（±s，个/200倍视野)Table 2 Comparison of CD4+T lymphocyte count in peripheral superficial lym ph nodes among the three groups (±s,cells/200 times visual field)

注：两两比较，AIDS组vs无症状组，P=0.000；AIDS组vs健康对照组，P=0.000；无症状组vs健康对照组，P=0.200

项目nCD4+T淋巴细胞计数AIDS组3267.604±42.273无症状组11198.727±76.334健康对照组12234.232±51.029 F值57.072 P值0.000

图2 HIV感染者外周浅表淋巴结中CD4+T淋巴细胞Figure 2 CD4+T cells in peripheral superficial lymph nodes of HIV-infected individuals

2.3 HIV感染者外周浅表淋巴结CD4+T淋巴细胞计数与胶原沉积及外周血CD4+T淋巴细胞计数相关性

2.3.1 HIV感染者外周浅表淋巴结中CD4+T淋巴细胞计数与胶原沉积的相关性43例HIV感染者外周浅表淋巴结内Ⅰ型胶原沉积量与CD4+T淋巴细胞计数呈负相关（R2=0.724，P=0.000）。直线回归方程为：外周浅表淋巴结中CD4+T淋巴细胞计数=237.408-2.283×Ⅰ型胶原沉积量（图3）。

2.3.2 HIV感染者外周浅表淋巴结中CD4+T淋巴细胞计数与外周血CD4+T淋巴细胞计数的相关性24例HIV感染者在行淋巴结活检当天留取外周血，分析显示外周血CD4+T淋巴细胞计数与淋巴结中CD4+T淋巴细胞计数呈正相关（R2=0.702，P=0.000）。直线回归方程为：外周血CD4+T淋巴细胞计数=2.056×外周浅表淋巴结中CD4+T淋巴细胞计数（个/mm3）－57.712（图4）。

图3 HIV感染者外周浅表淋巴结中CD4+T淋巴细胞计数与Ⅰ型胶原蛋白沉积量的相关性Figure 3 Correlation between CD4+T lym phocyte count and typeⅠcollagen deposition in peripheral superficial lymph nodes of HIV-infected individuals

图4 HIV感染者外周血CD4+T淋巴细胞计数与外周浅表淋巴结中CD4+T淋巴细胞计数的相关性Figure 4 Correlation between CD4+T lym phocyte count in peripheral blood and that in peripheral superficial lymph nodes of HIV-infected individuals

表3 3组外周浅表淋巴结中IL-7水平比较（±s，灰度）Table 3 Comparison of IL-7 level in peripheral superficial lym ph nodes among the three groups(±s,grey scale)

表3 3组外周浅表淋巴结中IL-7水平比较（±s，灰度）Table 3 Comparison of IL-7 level in peripheral superficial lym ph nodes among the three groups(±s,grey scale)

注：两两比较，AIDS组vs无症状组，P=0.126；AIDS组vs健康对照组，P=0.677；无症状组vs健康对照组，P=0.124

项目nIL-7 AIDS组32120.711±64.527无症状组11112.275±24.714健康对照组1289.424±40.861 F值1.447 P值0.245

2.4 HIV感染者外周浅表淋巴结中IL-7定量和分布健康对照组、无症状组和AIDS组外周浅表淋巴结中IL-7的分泌水平差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。而AIDS组部分患者淋巴结内IL-7呈局部聚集性表达（图5）。

图5 HIV感染者外周浅表淋巴结中IL-7的定量及分布图Figure 5 Quantitation and distribution of IL-7 in peri-pheralsuperficial lymph nodes of HIV-infected individuals

3 讨论

维持CD4+T淋巴细胞的相对正常数量以及功能，始终是HIV/AIDS治疗的焦点和核心。HIV感染后CD4+T淋巴细胞数量经历了一个动态变化的过程。在急性感染期，HIV大量复制，导致外周血CD4+T淋巴细胞迅速减少。急性期后，由于病毒特异性免疫的出现，病毒复制下降，外周血CD4+T淋巴细胞数量逐渐恢复至亚正常状态，继之进入一个漫长的缓慢下降过程，直至AIDS期。

HIV感染后机体CD4+T淋巴细胞数量的维持至少由4方面因素决定：①HIV感染直接或间接作用导致CD4+T淋巴细胞的消耗；②胸腺等中枢免疫器官CD4+T淋巴细胞的再生能力；③外周免疫器官对CD4+T淋巴细胞正常生存和发育的维持；④CD4+T淋巴细胞在血液及淋巴中的正常循环[5-6]。淋巴结作为重要的外周免疫器官，是淋巴细胞发生免疫应答的主要场所之一，对维持CD4+T淋巴细胞的生存、发育和循环发挥着关键作用[3，5-6]。而正常结构是淋巴结以上功能的基本保障，这是因为淋巴结的正常结构为CD4+T淋巴细胞的循环、发育和分化提供了支架及免疫微环境，保证CD4+T淋巴细胞能与树突细胞（dendritic cells,DCs）接触，并产生正确的免疫应答；作为淋巴结内T淋巴细胞区的基本骨架，成纤维网状细胞（fibroblastic reticular cells,FRCs）是体内IL-7的主要来源，而IL-7在维持T淋巴细胞稳态中发挥着关键作用[6-9]。

淋巴结中包含了机体70%的CD4+T淋巴细胞，是HIV感染的主要部位[9]。为了阐述HIV感染对淋巴结结构的影响，我们分析了HIV感染后Ⅰ型胶原蛋白在淋巴结中的沉积情况。结果表明随着病程的进展，HIV感染者外周浅表淋巴结中Ⅰ型胶原蛋白沉积逐渐增加，同时出现结构改变，最终导致淋巴滤泡萎缩乃至消失。前期有研究显示，HIV-1感染者淋巴结中胶原蛋白的沉积随着病程的进展而递增，导致副皮质区T淋巴细胞区结构破坏，其沉积的范围与淋巴组织中CD4+T淋巴细胞计数及抗反转录病毒治疗后外周血CD4+T淋巴细胞的变化呈负相关[10-13]。我们的研究也显示，虽然无症状组与健康对照组外周浅表淋巴结中的CD4+T淋巴细胞计数无显著差异，但AIDS组显著减少，且HIV感染者外周浅表淋巴结中CD4+T淋巴细胞计数与胶原沉积量呈负相关，与外周血CD4+T淋巴细胞计数呈正相关。一些晚期AIDS患者的淋巴结中CD4+T淋巴细胞几乎难以觅及，代之以大量胶原沉积。

IL-7对于初始T淋巴细胞的存活是必不可少的。IL-7缺乏可使外周T淋巴细胞逐渐减少，反之则可使外周初始T细胞群扩大[14]。淋巴结内T细胞区的FRCs是体内IL-7的主要来源之一[7-8]。为了进一步明确淋巴结结构破坏对CD4+T淋巴细胞的影响，我们分析了IL-7在HIV感染者外周浅表淋巴结中的定量及分布情况。结果显示，虽健康对照组、无症状组和AIDS组IL-7表达逐渐升高，但3组外周浅表淋巴结中IL-7的定量差异无统计学意义，而AIDS组部分患者淋巴结内IL-7呈局部聚集性表达。这提示，为了代偿CD4+T淋巴细胞的减少，淋巴结中IL-7的分泌有所增加，但仍不足以弥补疾病对CD4+T淋巴细胞的消耗，特别是由于淋巴结结构紊乱，IL-7聚集性分布，不能保证所有CD4+T淋巴细胞都能与IL-7充分接触，故仍难以维持其正常生存。

HIV感染后由于淋巴结结构的破坏，导致CD4+T淋巴细胞赖以生存的免疫微环境受损，使CD4+T淋巴细胞生存能力下降，并可能影响了其与DCs细胞的接触，不能产生正确的免疫应答；同时，由于胶原蛋白对淋巴细胞有粘附作用，胶原大量沉积，可能增加了对淋巴细胞的粘附能力，并影响淋巴结中淋巴细胞流入及流出道，进而影响CD4+T淋巴细胞的循环[15-17]。总之，HIV感染后外周浅表淋巴结中胶原沉积逐渐增加导致结构破坏，可能是CD4+T淋巴细胞进行性减少的一个重要原因，虽然IL-7有随病程进展而分泌增加的趋势，但仍不足以弥补淋巴结结构破坏对CD4+T淋巴细胞的影响。

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（2014-06-23收稿 2014-08-12修回）

（责任编委 王永怡 本文编辑 张云辉）

Correlation between CD4+T lym phocyte count in peripheral superficial lym ph nodes and collagen deposition in HIV-infected individuals

HUANG Lei,XUWen，LU Xiang-chan,DENG Jian-ning,
CHENWei-wei,NIEWei-min,QIN En-qiang,ZHAO Min*,ZHOU Xian-zhi*Treatment and Research Center for Infectious Diseases,302 Hospital of PLA,Beijing 100039,China
*Corresponding author,Zhao Min,E-mail:drzhaomin@sina.com;ZHOU Xian-zhi,E-mail:zxz.302@163.com

Objective To investigate the effects of collagen deposition on CD4+T lymphocyte count in peripheral superficial lymph nodesofHIV-infected individualsby detecting CD4+T lymphocyte count,collagen and interleukin(IL)-7 and analyze the correlation between CD4+T lymphocyte count and collagen deposition.M ethods Forty-three HIV-infected individualswere divided into asymptomatic HIV carriers(asymptomatic group)and AIDSpatients(AIDSgroup).Twelve subjectswithoutHIV infection were recruited as a control group.Peripheral superficial lymph nodes of all the groupswere obtained.Immunohistochemistry was used to detect expression and distribution of CD4+T lymphocytes,typeⅠcollagen and IL-7 in peripheral superficial lymph nodes.Results With disease progression,collagen deposition in peripheral superficial lymph nodes of HIV-infected individuals increased gradually.Collagen deposition in AIDSgroup was higher than that in asymptomatic group,which was higher than that in the control group,and differences between the three groupswere significant(P＜0.05).CD4+T lymphocyte counts in peripheralsuperficial lymph nodeswere notsignificantly differentbetween the asymptomatic group and the control group(P＞0.05),while thatof AIDSpatients decreased significantly(P＜0.01). CD4+T lymphocyte count in peripheralsuperficial lymph nodesofHIV-infected individualshad a strong negative linear correlationwith collagen deposition(R2=0.724,P=0.000),and a strong positive linear correlation with CD4+T lymphocyte count in peripheral blood (R2=0.702,P=0.000).Expressions of IL-7 in peripheral superficial lymph nodes were not significantly different among the three groups(P＞0.05),butpresented with localaggregation in some AIDSpatients.Conclusions Gradually increasing collagen deposition destroys the structure of peripheral superficial lymph nodes after HIV infection,whichmay be one of the important reasons for CD4+T lymphocyte depletion in lymph nodes.Although the expression of IL-7 has a rising tendency in lymph nodes of HIV-infected individualswith disease progression,destruction of lymph nodes structure remains a uncompensatory effecton CD4+T lymphocytes.

HIV;acquired immunodeficiency syndrome;collagen;CD4+T cells;interleukin-7

R512.91

A

1007-8134(2014)06-0337-05

国家自然科学基金项目（30771897、81072423）；全军医学科技“十二五”科研面上项目（CWS11J160）；南宁市科学研究与技术开发计划、创新计划项目科研课题（201003047C-1）

100039北京，解放军第三○二医院感染性疾病诊疗与研究中心（黄磊、许文、陈威巍、聂为民、秦恩强、赵敏、周先志）；530023，南宁市第四人民医院/广西艾滋病临床治疗中心艾滋病科（卢祥婵、邓建宁）

周先志，E-mail:zxz302@163.com；赵敏，E-mail:drzhaomin @sina.com