纳米壳聚糖纤维强化型磷酸钙骨水泥的研究*

许诺 吴天一 王国栋 袁同洲 黄野

经验交流

纳米壳聚糖纤维强化型磷酸钙骨水泥的研究*

许诺 吴天一 王国栋 袁同洲 黄野*

目的探讨纳米壳聚糖纤维强化型磷酸钙骨水泥的机械及生物相容性能。方法使用纳米壳聚糖纤维强化CPC骨水泥，通过MTT比色法及DAPI染色观察其生物相容性情况；通过三点弯曲试验检测其力学性能。结果三点弯曲试验表明经过壳聚糖纤维强化后的骨水泥的机械性能（17.3±4.5）MPa较之普通骨水泥有明显改善（5.3±1.4）MPa；并且这样的改进对材料的生物相容性没有影响，其毒性试验显示新材料相容性比值为（97.5±3.3）%。细胞增值实验3天吸光值分别为（0.237±0.025）、（0.451±0.015）、（0.726±0.032）。结论新型纳米壳聚糖纤维强化型骨水泥无细胞毒性，具有良好的机械性能及生物相容性。

磷酸钙骨水泥；强化；壳聚糖纤维

骨缺损的常见原因有：创伤、骨病理性改变、感染、骨肿瘤治疗等[1,2]。其中大段、大块骨缺损是目前骨科临床的治疗难点之一。目前临床上骨替代材料种类很多，如羟基磷灰石、硫酸钙人工骨、磷酸钙骨水泥（CPC）等。其中磷酸钙骨水泥由于其生物相容性好、操作方便等优势，得到了广泛关注。但大段磷酸钙骨水泥人工骨的研制是组织工程的难点，难点集中于人工骨可吸收替代性与强度的矛盾关系。人工骨的生物学性能要求人工骨要有较高的孔隙率以允许细胞和体液的进入以便于人工骨的吸收，而力学性能则要求人工骨植入初期，需要有良好的力学性能以保证其成骨空间。但CPC由于机械化性能较差不能构建大段人工骨或仅能应用在非负重区[3-5]。

一些研究者对CPC进行强度能力的改进。研究者通过在CPC粉末中加入壳聚糖或明胶，想达到了强化其机械性能的目的[3]。但单纯将壳聚糖粉剂与CPC混合并不能提高CPC力学性能[6]。我们将壳聚糖制成纤维丝，并与CPC混合，期望能提高该新型CPC的力学强度，并同时评估其的生物相容性。

1 材料与方法

1.1 纳米壳聚糖磷酸钙骨水泥的制作

磷酸钙骨水泥购买自上海Rebone公司。壳聚糖（分子量150000）购买自浙江元化生物技术公司。直径300～400nm的纳米壳聚糖丝的制作由华东理工大学高分子材料学院完成。试验分为三组：CPC骨水泥（CPC）；改进型骨水泥通过纳米壳聚糖丝（F-CPC）（均匀切成9.5mm的短丝）按照9.5%的体积分数与CPC粉末均匀混合；普通的壳聚糖粉末（C-CPC）也按照相同的体积分数与CPC骨水泥进行混合。使用聚乙酸树脂模子（直径10mm，高度5mm）将三组磷酸钙骨水泥压制成大小相同的小圆片用于细胞毒性试验。使用聚乙酸树脂模子（直径10mm，高度25mm）将三组磷酸钙骨水泥压制成大小相同的小圆柱用于材料强度试验。

1.2 材料毒性试验及细胞扩增试验

小鼠成纤维细胞系L929被用来进行材料的毒性及细胞增值实验的研究。细胞毒性试验通过对材料的浸提液的检测进行。DMEM培养液用来对材料进行浸提液的制作，浸提液的制作按照ISO标准进行。L929细胞按照1.5×103/ml的浓度在材料表面培养24小时后将培养液换为材料浸提液继续培养24小时。MTT（Sigma公司，St Louis,MO）方法被用来检测材料的毒性，5mg/ml的MTT溶液被加入培养板37°C条件下孵育4小时后去除培养基。经过MTT反应的结晶溶解于DMSO，溶液的吸光度（A560nm）通过分光光度计（Perkin-Elmer）进行检测。细胞的扩增试验同样应用L929细胞进行测试，细胞以10000个/ml的浓度接种于材料表面，在经过1、2、3天培养后对其进行MTT检测以测定其增值情况。同时24小时培养后的样品在经过PBS漂洗后进行DAPI（Sigma公司，St Louis,MO）染色，对通过10分钟DAPI溶液染色后的样品进行荧光显微镜观察照相，其结果与之前的MTT结果共同构成材料学的生物相容性检测。

1.3 材料强度测试

材料的强度通过力学三弯曲试验进行测试。三点弯曲试验的测试参数设计为：全长20mm，弯曲速度0.5mm/min。材料明显形变或断裂时所承受的最大力作为材料的最大弯曲强度（MPa）[7]。

2 结果

2.1 材料毒性实验结果

材料的毒性通过MTT实验检测细胞在材料浸提液中的增值情况得出（图1）。细胞在各种材料浸提液中MTT检测得出的A值与使用普通DMEM培养液测出的A值进行比较，所得出的比例按照以下指标进行检测：强（<30%）；较强（30%～60%）；中等（60%～90%）；无毒性（>90%）。试验结果：CPC组（91.3±3.1）%；C-CPC组（90.1±11.7）%；F-CPC组（97.5±3.5）%（图1）。3种材料均没有表现出明显的毒性。

图1 材料毒性试验。图中可见几种材料均不显现出毒性

2.2 细胞增值实验结果

细胞在材料表面的增值情况通过MTT实验（图2）与对材料表面粘附细胞的荧光染色（图3，彩图见插页）共同检测。从MTT的A值结果（表1）中可见，3种材料对于3天时间内细胞的增值并没有明显差异。DAPI染色为细胞核染色，L929细胞的细胞核在荧光显微镜下显现出蓝色荧光。图2和图3中表现出细胞在3种材料表面的粘附增值情况无明显差异。

表1 3组材料的MTT的A值结果

图2 1、2、3天材料表面细胞增值情况，在3天时间内，材料表面细胞增值情况没有明显差异

图3 材料表面细胞增值24小时后细胞核荧光染色情况，L929的细胞核在DAPI染色后显现出蓝色荧光（A：CPC,B：C-CPC,C：F-CPC）

2.3 材料力学性能测试

三点弯曲试验被应用来检测材料的机械性能（图4）。不同材料的机械性能由材料的最大弯曲强度（MPa）来表示（表2）。由试验可见经过壳聚糖丝强化的CPC材料（F-CPC）的强度均得到了有效的改善。而使用壳聚糖粉末进行改进的CPC骨水泥（C-CPC）强度与普通CPC骨水泥没有明显差异。

表2 3组材料最大弯曲强度

图4 材料力学性能测试，较之未加入壳聚糖丝强化的普通CPC和CCPC，F-CPC的强度明显得到改善。（P＜0.05）

3 讨论

CPC具有良好的生物相容性与生物降解性，是临床较为常用的骨替代材料；并且由于其良好的操作性能，近些年对其的使用也越来越广泛。但其较低的力学强度使其仅能应用在骨的“非受力区域”。所以，我们认为CPC在改进过程中应着重对其机械性能进行改进，从而使其更好的应用在骨科手术过程中。

有研究者使用不同种类的纤维与CPC混匀来改善CPC的强度,如聚磷酸钙纤维、纳米碳管纤维等，以往的研究发现加入纤维材料后对CPC的强度都有增强[3]；在使用这样的方法对CPC强度进行改进时，选用纤维的种类、纤维长短以及纤维所占比例均会对最终的力学强度造成影响[8]。但此类纤维需具备满意的生物相容性和生物可降解性[9]。由于壳聚糖本身具有良好的生物相容性，使用其作为原料进行电纺丝加工后的壳聚糖纤维很好的继承了其原有的生物相容性的特点。通过本实验数据，发现经过壳聚糖纤维强化的CPC（FCPC）力学强度普遍比普通CPC及混合壳聚糖粉的CPC（CCPC）有明显提升。因此，这种可吸收纤维大大加强了CPC可吸收性骨水泥的机械性能。

壳聚糖作为一种天然高分子的生物官能性和相容性、血液相容性、安全性、微生物降解性等优良性能被各行各业广泛关注。研究发现壳聚糖也可以复合纳米羟基磷灰石，用于骨组织工程修复[10]。大量的研究证实混合壳聚糖的CPC，具有良好的生物相容性，并且可被降解[11,12]。本研究结果也表明使用壳聚糖纤维强化的CPC在强度上较之普通CPC及壳聚糖粉强化的CPC有明显改善，并且使用这种方法改进的骨水泥具有较好的生物相容性。但该骨水泥显微结构特性和体内降解性和成骨性能还需进一步研究。

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A new strength-reinforced calcium phosphate cements

ObjectiveTo evaluate the mechanical behavior of the new calcium phosphate bone cement（CPC）.MethodsThe CPC was reinforced by chitosan fiber. The strength of the samples was investigated by a standard three-point bending test.Cell toxicity and proliferation of cells were also invested.ResultsThe results of three-point bending test also showed the incorporation of chitosan fiber（17.3±4.5）MPa significantly increased the mechanical strength of CPC（5.3±1.4）MPa.And the reinforcement is not harmful to the biocompatibility of CPC.Extracts of new bone cement showed noncytotoxic（97.5±3.3）%.TheMTT activity of cells is（0.237±0.025）,（0.451±0.015）,（0.726±0.032）during3 days cultured.ConclusionCPC combined with chitosan fiber can meet the needs of strength and biocompatibility.

CPC bone cement;Reinforcement;Chitosan fiber

R318.08

B

许诺（1977-）男，本科，主治医师。研究方向：骨折创伤与修复。

*[通信作者]黄野（1957-）男，本科，主任医师，硕士生导师。研究方向：骨与关节创伤修复。

2013-08-15

南京医科大学校基金项目（2010NJMU092）

南京医科大学第二附属医院，江苏南京，210011