HPLC法测定7-ACT相关杂质含量

罗艳平，王建霞

(深圳九新药业有限公司，广东 深圳 518049)



HPLC法测定7-ACT相关杂质含量

罗艳平，王建霞

(深圳九新药业有限公司，广东 深圳 518049)

目的：建立头孢曲松钠生产中中间体7-ACT相关杂质的HPLC测定方法。方法：采用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱(0.15m×4.6mm×1.0μm)，紫外检测器，检测波长：270nm，流动相：3.2g四庚基溴化铵置400mL乙腈中，加入44mL pH7.0磷酸盐缓冲液和4mL pH5.0枸橼酸盐缓冲液，加水稀释至1 000mL，过滤，流速：1.0mL/min,进样量20μL，自身对照法测定7-ACT的相关杂质含量。结果：7-ACT在0.06～3.6ppm浓度范围内呈现良好的线性关系(相关系数为0.9999)，精密度RSD(n=6)为1.4%；定量限：7-ACT、7-ACA达到0.048ppm，三嗪环达到0.012ppm。结论：本方法专属性强，操作简便，结果可靠，可用于7-ACT中相关杂质的测定。

高效液相色谱法；7-ACT；反相色谱柱；相关杂质

头孢曲松钠为半合成的第三代头孢菌素，对大多数革兰阳性菌和阴性菌都有强大抗菌活性，抗菌谱包括绿脓杆菌、大肠杆菌、肺炎杆菌、流感嗜血杆菌、产气肠细菌、变形杆菌属、双球菌属及金葡菌等。7-ACT是生产头孢曲松钠的中间体，因此在生产过程中的起始物料(7-ACA、三嗪环)的残留及未知杂质的控制，对终端产品杂质控制起关键性的作用。本文建立了高效液相色谱法测定7-ACT的相关物质，方法简单，重现性好。

1 仪器与试药

HPLC：安捷伦(含在线脱气机、自动进样器、四元泵、柱温箱、多波长紫外检测器)；7-ACT：(深圳九新药业有限公司，批号：110401，110402，110403)；磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、枸橼酸钠、枸橼酸、乙腈、四庚基溴化胺为分析纯或色谱纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：十八烷基硅烷健合硅胶为填充剂；规格：l=0.15m，Φ=4.6mm；流动相：取3.2g四庚基溴化铵置400mL乙腈中，加入44mL pH7.0磷酸盐缓冲液和4mL pH5.0枸橼酸盐缓冲液，加水稀释至1 000mL,过滤。流速：1.0mL/min,检测器：紫外检测器，检测波长：270nm,进样量： 20μL，运行时间：2.5倍主峰保留时间。按自身对照法计算杂质含量。

2.2 溶液制备

2.2.1 pH7.0磷酸盐缓冲液 取磷酸氢二钾1.36g，磷酸二氢钾0.4g，置100mL水中溶解后，用磷酸溶液(80%)或氢氧化钾溶液(10mol/L)调节pH至(7.0±0.1)。

2.2.2 pH5.0枸橼酸盐溶液 取2.58g枸橼酸钠于50mL水中溶解后，用枸橼酸(5g溶解在25mL水中)调节pH至(5.0±0.1)。

2.2.3 测试溶液 取供试品约30mg，加流动相100mL使溶解，摇匀，即得。

2.2.4 参照溶液(a) 取测试溶液1.0 mL，用流动相稀释定容至100.0mL。

2.2.5 参照溶液(b) 分别取5.0mg 7-ACA、三嗪环对照品及5.0mg 7-ACT对照品，用流动相溶解稀释定容至100.0mL。

2.3 专属性及系统适用性(参照溶液b)

取参照溶液b，进样，结果显示：分离度大于1.5，见表1。系统适用性考察见图1。

表1 专属性及系统适用性考察

图1 系统适用性考察

2.4 线性关系考察

储备溶液：称取30mg 7-ACT，用流动相溶解并定容至100mL。取10mL此溶液用流动相溶解并定容至100mL。0.02%API溶液： 取储备溶液1mL用流动相溶解并定容至50mL，取此溶液1.0mL用流动相溶解并定容至10mL。0.03%API溶液： 取储备溶液1mL用流动相溶解并定容至50mL，取此溶液1.5mL用流动相溶解并定容至10mL。0.24%API溶液：取储备溶液0.60mL用流动相溶解并定容至25mL。0.36%API溶液：取储备溶液0.90mL用流动相溶解并定容至25mL。0.60%API溶液：取储备溶液1.50mL用流动相溶解并定容至25mL。1.20%API溶液：取储备溶液3.00mL用流动相溶解并定容至25mL。

计算每份溶液进样3次的主峰面积的RSD，记录色谱图，以浓度(mg/mL)为横坐标，峰面积为纵坐标，求得标准曲线，结果显示：7-ACT在所选浓度范围内线性良好，回归方程：Y=64 185X+1.5817，相关系数：0.999 9，标准曲线的相关系数均大于0.999 9。见表2。

表2 线性关系考察结果

2.5 精密度考察

取参照溶液(a)，连续进样6次， 计算7-ACT峰面积RSD，结果显示：本方法的精密度良好。见表3。

表3 精密度测定结果

2.6 检测限和定量限测定

储备溶液：制备7-ACA三嗪环及7-ACT溶液，浓度为0.003mg/mL。检测限：用储备溶液不断稀释测试直至峰高与噪声比值为3。定量限：用储备溶液不断稀释测试直至峰高与噪声比值为10。检测限和定量限测定结果结果见表4、图2。结果显示对以上杂质检测灵敏。

表4 检测限和定量限测定结果

2.7 中间精密度

2个分析检验人员，3天，分别取样品1批，按"3.3"项下方法配制，分别精密取测试溶液和参照溶液(a)20μL，用自身对照法计算样品的7-ACA、三嗪环、最大未知杂质的结果，并计算结果的RSD。见表5。

图2 7-ACA检测限及定量限

图3 三嗪环检测限及定量限

图4 7-ACT检测限及定量限

表5 精密度试验结果

2.8 样品测定

取样品3批(批号：110401，110402，110403)1.0g，按“3.3项”下方法配制，分别精密取测试溶液和参照溶液(a)20μL，用自身对照法计算3批样品的7-ACA、三嗪环、最大未知杂质，测定结果见表6，色谱见图5。

2.9 溶液稳定性实验

取样品1批，按“3.3”项下方法配制，在冷处/常温环境下，分别于0h、1h、2h、3h、4h时间取样品，测试溶液。溶液在冷处放置1h内是稳定的，应现配现用。结果见表7。

图5 对照溶液及样品溶液色谱

表6 样品杂质测定结果

表7 稳定性试验结果

3 讨论

本测定方法系统适用性试验结果证明五种溶剂峰的理论塔板数均大于5 000，相互分离度均远大于1.5，说明能良好分离，且没有干扰。

精密度考察结果证明五种溶剂峰面积的RSD均小于5.0%，本测定方法精密度符合要求。

回收率试验结果证明五种溶剂、三种浓度回收率均在90.0%～110.0%之间，3次平行测定的RSD均小于5.0%，本测定方法准确性符合要求。

本测定方法专属性强，操作简便，结果可靠，可用于头孢替坦二钠中五种残留溶剂的同时测定。

[1] 周海钧.药品注册的国际技术要求.质量部分[M]．北京:人民卫生出版社,2007:126-140.

[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].二部.北京:中国医药科技出版社,2010:附录ⅧP.

(责任编辑：宋勇刚)

HPLC Method Determination of Related Substance in 7-ACT

Luo Yanping, Wan Jianxia

(Shenzhen Gosun Pharmaceutical Co.,LTD.,Shenzhen 518049,China)

Objective:To establish a method for determination of related substance of 7-ACT by High Performance Liquid Chromatography. Methods:The column was octadecylsilane chemically bonded silica. Mobile phase - Dissolve 2.0 g of tetradecylammonium bromide in 400 mL of acetonitrile, add 44 mL of pH 7.0 phosphate buffer and 4.0mL of pH 5.0 citric acid buffer, and dilute to 1000 mL with water, membrane filtered.Detector: VWD Wavelength of detection：270nm ,Flow rate：1.0mL/min; Injection Volume : 20 ul,A self-calibrated method for determination of related substance of 7-ACT.Results:Under the above condition, there is a good linear relationship in the concentration range measured.Conclusion:The method is simple, accurate and reproducible. Can be used for determination for determination of related substance of 7-ACT.

High Performance Liquid Chromatography; 7-ACT, Reversed-phase Chromatography Column; Related Substance

2014-11-28

罗艳平(1964-)，女，深圳九新药业有限公司工程师，研究方向为药品检验。

R927.2

A

1673-2197(2014)09-0014-04