黄芩中汉黄芩素的提取制备

李文娟，潘 馨，陈晓兰，陈维中，廖联明*

(1.福建中医药大学，福建 福州350122；2.南京军区福州总医院第一附属医院，福建 莆田 351100)



黄芩中汉黄芩素的提取制备

李文娟1，潘 馨1，陈晓兰2，陈维中2，廖联明1*

(1.福建中医药大学，福建 福州350122；2.南京军区福州总医院第一附属医院，福建 莆田 351100)

为建立制备大量高纯度汉黄芩素的方法，将中药黄芩50g用pH 5水水解12h，再用95%的乙醇提取，得到的提取物浸膏，过30～60目的聚酰胺树脂柱纯化，将含有汉黄芩素的洗脱物采用高速逆流色谱(HSCCC)进行分离。通过该方法制得汉黄芩素525mg，纯度为98.7%。

汉黄芩素；黄芩；提取；聚酰胺柱；纯化；高速逆流色谱

黄芩为唇形科(Labiatae)植物黄芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)的干燥根，是常用中药。主要生物活性成分为黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素，其中汉黄芩素生物活性广泛，具有抗氧化、清除自由基、抗炎、抑制肿瘤作用[1]，尤其是其抗肿瘤活性引起广泛研究。本实验拟通过对黄芩自身酶催化水解使汉黄芩苷转化为汉黄芩素，以提高原药材中汉黄芩素的含量。用高速逆流色谱(HSCCC)制备汉黄芩素。高速逆流色谱是一种独特的液-液分配色谱分离技术，两相液体互不相溶，一相作为固定相，另一相作为流动相，待分离物质在两相中的分配系数不同而实现分离。目前用高速逆流制备汉黄芩素的研究较少，本实验用溶剂体系对黄芩中汉黄芩素的纯化制备，探索最佳纯化制备条件。

1 仪器、试剂与材料

1.1 仪器

电热套(天津泰斯特仪器有限公司)；玻璃层析柱(40mm×600mm)；1200高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；高速逆流色谱仪(上海同田生化技术有限公司HSCCC-TBE300A)。

1.2 试剂与材料

乙醇、甲醇、正己烷、乙酸乙酯、磷酸(分析纯，天津市福晨化学试剂厂)；甲醇(色谱纯，国药集团化学试剂有限公司)；双蒸水、超纯水，自制。聚酰胺树脂(国药集团化学试剂有限公司)；汉黄芩素(批号：MUST-12092303，中国科学院成都生物研究所)；黄芩药材(购自安徽同泰药业有限公司)。

2 实验方法

2.1 黄芩的提取纯化

取黄芩粉末50g，精密称定，置1 000mL容量瓶中，加入pH为5的超纯水，浸泡12h，加入10倍体积95%乙醇，提取2次，每次2h。合并提取液，过滤，浓缩回收乙醇，得到浸膏。浸膏加水，使其呈混悬状态，进行聚酰胺层析柱上样，上样量2g/100mL，依次用水、30%、60%、95%乙醇洗脱。将含有汉黄芩素的洗脱液合并，浓缩干燥，得到黄色粉末。

2.2 溶剂体系和样品溶液的配制

在分液漏斗中配制正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(体积比7∶3∶5∶5)两相溶剂体系，充分振摇后在室温下静置。分离上下相，使用前分别超声脱气30min，待用。取纯化粉末40mg，用等体积的上下相溶剂体系溶解，溶解液作为样品溶液，备用。

2.3 高速逆流色谱法的分离制备

用最大流速(9.99mL/min)向HSCCC分离管中泵入上相，待上相充满整个管路后，调整主机转速为850r/min，以2.0mL/min流速泵入下相，待流动相从柱出口流出，两相在分离管中达到动态平衡后，注入样品溶液20mL，在275nm波长下检测，记录色谱图，根据色谱图接收目标成分。

2.4 高效液相色谱分析条件

色谱柱：Hypersil ODS C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm，大连依利特)，流动相为甲醇-0.1%磷酸水(54∶46)，流速为1.0mL/min，柱温30℃，检测波长275nm，进样量10μL。

2.5 标准曲线绘制

精密称取汉黄芩素(纯度99.5%)对照品1.83mg，置于10mL容量瓶中，用甲醇溶解，摇匀，至刻度定容，作为对照品贮备液。分别进样5、10、15、20、25μL，按上述色谱条件测定峰面积值。以进样量为横坐标(X)，以峰面积值为纵坐标(Y)进行线性回归，得回归方程：Y=5 397.1X-751.38，R2=0.999 9，线性范围为0.915～4.575μg。

3 结果

3.1 黄芩提取纯化

本实验按上述提取方法得浸膏21.6g，得膏率为43.2%，浸膏经HPLC测得汉黄芩素含量为3.267%。提取浸膏过30～60目聚酰胺层析柱，汉黄芩素存在于60%乙醇洗脱液中，洗脱液浓缩干燥后得到5.1g黄色粉末，经HPLC测得汉黄芩素含量为13.57%。

图1 黄芩粗提物的HPLC色谱

图2 过聚酰胺层析柱纯化的黄芩提取物的HPLC色谱

3.2 高速逆流色谱法的制备

一般用于HSCCC的溶剂系统，应满足下列几个方面的要求[2]：①不造成样品的分解或变性；②足够高的样品溶度；③样品在系统中有合适的分配系数值；④固定相能实现足够高的保留；⑤溶剂易挥发以方便后续处理。其中固定相的保留率要达到50%以上，分配系数K值在0.5～2之间可以得到很好的分离效果。

汉黄芩素是一种黄酮类化合物，极易溶于甲醇、乙醇、丙酮，溶于醋酸乙酯和氯仿，微溶于苯和水，不溶于石油醚[1]。根据其性质，本实验选择疏水性体系正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水。根据文献[3]，将样品溶于等体积的上下相中，分别取等体积的上下相进行HPLC分析，根据公式：K=cs /cm(cs ：溶质在固定相中的浓度；cm ：溶质在流动相中的浓度)[2]从而计算汉黄芩素的分配系数，选择汉黄芩素分离系数在0.5～2之间的体系，进行高速逆流实验，根据分离效果，最后选定正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水比列为7∶3∶5∶5分配体系，保留率R为77.73%。结果见表1。

表1 不同溶剂体系中汉黄芩素的分配系数

通过以上条件进行HSCCC分离纯化，结果见图3，谱图显示汉黄芩素在2h左右出峰，持续时间30min，可以看出汉黄芩素峰与其前后峰均分开。从5.1g过聚酰胺层析柱纯化的黄芩提取物进一步纯化得到525mg汉黄芩素，经HPLC分析其纯度为98.7%。HPLC色谱及其紫外光谱见图4。

图3 过聚酰胺层析柱纯化的黄芩提取物的HSCCC色谱

图4 HSCCC汉黄芩素流分的HPLC色谱

4 讨论

黄芩中汉黄芩素含量较低，据文献报道不同产地含量不同，大约范围为0.01%～0.35%[4]。参考现有的提取方法和汉黄芩素的极性大小，本实验采用自身酶水解法使汉黄芩苷转化为汉黄芩素，加入4倍体积pH为5的水酶解12h[5-8]。4倍体积水不仅满足了水解的需要，而且水解完成后基本上没有剩余水分；12h可以保证水解完全。汉黄芩素属黄酮类化合物，因其本身所带有的酚羟基较多而在溶液中不稳定，根据文献记载本实验选择pH为5的水进行水解；根据文献记载95%乙醇[9-10]能使汉黄芩素较充分地溶出，故本实验采用95%乙醇进行提取。结果表明本实验的提取得膏率及其中汉黄芩素含量均较高。

黄芩粗提物的HPLC色谱(见图1)主要有2个物质的峰，其中在25min左右的峰为汉黄芩素，几乎没有看到汉黄芩苷出峰，说明汉黄芩苷水解为汉黄芩素，增加了汉黄芩素的含量。图2说明过完60目聚酰胺层析柱的提取物中弃除了一些杂质，提高了汉黄芩素纯度，为后面的HSCCC分离减轻了难度。

本实验HSCCC体系方法不仅可以把汉黄芩素完全分离出来，也可以将前面出现的大峰物质及其后面的小峰物质分离出来，表明本系统分离度良好。配备的固定相和流动相，跑完一次样品差不多都可以用完，不会造成其中一相过度剩余而浪费试剂。实验结果表明，本方法简便、重现性好。

[1] 任晓东，符伟，张晓芸，等.天然产物汉黄芩素的研究进展[J].中国新药杂志，2011，20(9):777-784.

[2] 张天佑，王晓.高速逆流色谱技术[M].北京：化学工业出版社，2011.

[3] 曹学丽.高速逆流色谱分离技术及应用[M].北京：化学工业出版社，2005.

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[6] 刘志刚，颜仁梁，徐昌瑞，等.正交试验法优选黄芩总黄酮苷元酶解后提取工艺[J].中药新药与临床药理，2008，19(2)：143-145.

[7] 李晓燕，赵韶华，韩桂茹，等.自身酶解法测定黄芩药材中黄芩素和汉黄芩素的含量[J].中国药业，2012，2l(9)：10-11.

[8] LI LI DONG, YU JIE FU, YUAN GANG ZU, et al.An enhanced preparation and purification of the major antioxidants baicalein and wogonin from scutellariae radix[J].Food Chemistry，2012(133)：430-436.

[9] 唐浩国.黄酮类化合物研究[M].北京：科学出版社，2009.

[10] 梁英，王志，韩鲁佳.黄芩中3种主要黄酮类化合物的提取及测定[J].黑龙江八一农垦大学学报，2006，18(5)：73-76.

(责任编辑：宋勇刚)

Extraction and Preparation of Wogonin from Radix Scutellariae

Li Wenjuan1,Pan Xin1,Chen Xiaolan2,Chen Weizhong2,Liao Lianming1﹡

(1.Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122,China; 2.Fuzhou General Hospital of Nanjing Military Region, the First Affiliated Hospital, Fujian 350122,China)

To develop a method for large scale preparation of high-purity Wogonin from Radix Scutellariae. 50g of Radix Scutellariae was hydrolyzed in water (pH 5) for 12h,and then extracted with 95% ethanol.The extractum was seperated with 30～60 mesh polyamide resin column. Fraction with Wogonin was subjected to high-speed countercurrent chromatography (HSCCC ) . 525mg Wogonin is obtained with a purity 98.7%. Thus an effective method for preparing high-purity Wogonin was established.

Wogonin; Radix Scutellariae; Extraction; Polyamide Resin Column; Purifion；HSCCC

2014-01-03

李文娟(1985-)，女，福建中医药大学硕士研究生，研究方向为中药抗肿瘤活性成分。

作者简介：廖联明(1968-)，男，福建中医药大学副教授，研究方向为中药抗肿瘤机制。E-mail：llm@fjtcm.edu.cn。

R284.2

A

1673-2197(2014)09-0033-02