海棠果中总黄酮的含量测定

罗永会，张翠香，徐春萍，左绍远，刘云春

(大理学院 基础医学院 ，云南 大理 671000)



海棠果中总黄酮的含量测定

罗永会，张翠香，徐春萍，左绍远，刘云春

(大理学院 基础医学院 ，云南 大理 671000)

目的：建立海棠果中总黄酮的含量测定方法。方法：以芦丁为对照品，用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色，采用分光光度法测定海棠果中总黄酮的含量。结果：海棠果中总黄酮的含量为10.04%，精密度实验RSD为0.78%；稳定性实验RSD为2.30%,在90min内稳定性较好；重复性实验RSD为0.69%；芦丁对照品浓度在0～100μg/mL范围内呈良好线性关系，回归方程为:Y= 0.010 9X-0.001 2，相关系数 R2=0.999 8；平均加样回收率为98.71% ，RSD为1.38%。结论：该方法简便、稳定，可用于海棠果中总黄酮的含量测定。

海棠果；总黄酮；芦丁；含量测定

黄酮类化合物是一类重要的天然有机化合物，广泛存在于蔬菜、水果及药用植物中，是植物在长期自然选择过程中产生的一类次生代谢产物,具有抗炎、抗病毒、利胆、强心、镇静和镇痛以及降压、降血脂、抗氧化、抗衰老、免疫调节和抗肿瘤等作用[1-4]。近年来黄酮类化合物成为新药开发研究中一个非常重要的资源，具有广阔的开发应用前景。

海棠果(Malus prunifolia)又名楸子、海红、红海棠果、柰子，属蔷薇科(Ro-saceae)、苹果亚科(Maloideae)，落叶小乔木[5]。原产我国，现主要分布在华北、河北、东北南部，内蒙古及西北也有。云南西北部的大理、丽江等地区亦有种植。民间认为：海棠果能解毒生津，健胃止渴，降火利尿，助消化，预防和治疗便秘，对小儿尿道炎有特效，是一种纯正的天然保健珍品，长期食用海棠果产品有健脑、增强免疫力、抗疲劳等作用，尤其是具有抗肿瘤作用[6-8]。但有关海棠果总黄酮的研究尚未见报道，本研究采用单因子试验和正交试验对提取海棠果总黄酮的最佳条件进行探索，并对其含量进行测定，为进一步开发海棠果提供理论依据。

1 仪器与材料

1.1 材料和试剂

海棠果购于云南丽江市古城农贸市场。芦丁、石油醚(沸程60～90℃)、无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠购于国药集团化学试剂有限公司，均为分析纯。

1.2 主要仪器

BT-224S型电子分析天平( 德国赛多利斯仪器公司)；HH-4数显恒温水浴锅(常州国华电器有限公司)；TDL-4A低速离心机(上海菲恰尔仪器有限公司)；722E分光光度计(上海分析仪器有限公司)；RA-6000旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；中药粉碎机。

1.3 样品预处理

海棠果果干于60℃干燥24h，粉碎。加入10倍体积的石油醚，65℃水浴回流2h，重复2次，脱脂及去除色素，室温挥干有机溶剂，干燥得脱脂海棠果粉样品，备用。

2 方法与结果[9-16]

2.1 芦丁标准曲线的绘制

精确称取120 ℃干燥恒重的芦丁标准品100.0mg，用50%乙醇定容至100mL，则芦丁标准液的浓度为1.0mg/mL，准确吸取对照品溶液0.0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mL，置于10mL试管中，分别加50%乙醇至2.0mL混匀，加5%亚硝酸钠溶液0.3mL混匀，放置6min，加10%的硝酸铝溶液0.3mL混匀，放置6min后加5%的氢氧化钠溶液2.0mL，混匀，放置15min加50%乙醇至10.0mL混匀，以第1管为空白对照，于510nm处测定吸光度，以芦丁浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，结果见图1。

图1 芦丁标准曲线(510nm)

求得回归方程为:Y= 0.010 9X-0.001 2，R2=0.999 8。芦丁对照品浓度在0 ～ 100 μg /mL范围内呈良好线性关系。

2.2 海棠果总黄酮提取方法的确定

通过对提取溶剂的浓度、料液比、温度、时间等单因素实验，对主要的提取影响因素进行考察。结果如下。

2.2.1 料液比对黄酮含量的影响 采用65%的乙醇，分别以1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶60、1∶100料液比，40℃提取1.5h，提取1次，测定总黄酮含量，结果如图2，随料液比的增加，总黄酮的含量也随之增大，料液比为1∶60时达到最大为7.54%，故海棠果总黄酮提取的最佳料液比为1∶60。

图2 黄酮含量与料液比的关系

2.2.2 温度度对总黄酮含量的影响 按1∶60料液比，采用65%的乙醇，分别以20、40、60、70、80、90、100℃为提取温度，提取1.5h，提取1次，测定总黄酮含量，结果如图3，随温度的升高，总黄酮的含量随之增大，温度达到80℃时，含量达到最大，之后则随温度的升高反而降低。故海棠果总黄酮的提取温度选择80℃。

图3 黄酮含量与提取温度的关系

2.2.3 浸提时间对总黄酮含量的影响 采用65%的乙醇按1∶60的料液比，80℃分别提取0.5、1.0、1.5、 2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h，提取1次，测定总黄酮含量，结果如图4。随时间增长，海棠果总黄酮的含量有所增加，当提取时间为3h时，达到最大含量9.65%，之后随时间增长则降低。故海棠果提取的时间为3h。

图4 黄酮含量与提取时间的关系

2.2.4 乙醇浓度对总黄酮含量的影响 分别用0%(去离子水)、20%、30%、40%、50%、65%、80%、95%乙醇浓度，按料液比为1∶60(g/mL)，40 ℃提取3.0 h，提取1次，测定总黄酮含量，结果如图5，随乙醇浓度的增加总黄酮含量随之增大，当乙醇浓度增加到50%时，海棠果总黄酮含量达到最大为9.92%，之后则随乙醇浓度的增加，总黄酮含量则反而降低。故黄酮提取的乙醇浓度为50%。

图5 黄酮含量与乙醇浓度的关系

综合上述实验结果，从料液比、浸提温度、乙醇浓度、浸提时间四个因素综合考虑，选择料液比为1∶60(g/mL)、浸提温度为80℃、50%乙醇为浸提剂、浸提时间为3.0h，提取海棠果中的总黄酮，可得到较好的效果。

2.2.5 海棠果总黄酮提取液的制备及含量测定 准确称取1.00g脱脂海棠果粉，按1∶60(g/mL)料液比，用50%乙醇为浸提剂,80℃浸提3.0h，过滤，用50%乙醇溶液定容到100mL，得总黄酮提取液，备用。准确吸取1.0mL置于50mL容量瓶中，用50%乙醇溶液定容到刻度。吸取2.0mL，按照“2.1”方法操作，于510nm处读取吸光度,代入线性回归方程，求出样品液中总黄酮浓度，计算海棠果中总黄酮的含量约为10.04%。

海棠果中总黄酮的含量=C×V×N×10-6/M×100%

其中：C：样品总黄酮浓度(μg/mL)，M：海棠果干粉质量(g)，V：待测样品总体积(mL)，N：待测溶液的稀释倍数，10-6：单位换算(1g=10-6μg)。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验 精密吸取总黄酮提取液2.0mL，共5份，按“2.1”项方法操作，在510nm波长处测定吸光度，计算总黄酮含量，RSD=0.78%，表明仪器精密度良好。结果见表1。

表1 精密度试验结果 (n=5)

2.3.2 稳定性试验 精密吸取总黄酮提取液2.0mL，按“2.1”项方法操作，分别放置于室温0、15、30、60、90min之后，在510nm波长处测定吸光度，RSD=2.30%，表明其在显色后的90min内稳定性较好。结果见表2。

表2 稳定性试验结果 (n=5)

2.3.3 重复性试验 精密称取脱脂海棠果粉1.00 g，共5份，按“2.2.5”项方法提取总黄酮，按“2.1”项方法操作，分别在510 nm波长处测定吸光度，计算总黄酮含量， RSD=0.69%，表明试验的重复性良好。结果见表3。

表3 重复性试验 (n=5)

2.3.4 加样回收率试验 精密称取脱脂海棠果粉5份，每份为0.5 g，分别加入1.0 mg/mL芦丁1.0 mL，按“2.2.5”项方法提取总黄酮，按“2.1”项方法操作，分别在510nm波长处测定吸光度，平均回收率为98.71%，RSD=1.38%，表明测定方法可靠性强。结果见表4。

3 讨论

本实验通过对提取溶剂浓度、料液比、温度及提取时间等单因素进行实验，建立了海棠果总黄酮的提取方法：以1∶60的料液比用50%乙醇在80 ℃浸提3.0h。以芦丁为对照品，用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色，采用分光光度法测定海棠果中总黄酮的含量。精密度实验RSD为0.78%；稳定性实验RSD为2.30%,在90min内稳定性较好；重复性实验RSD为0.69%；平均加样回收率为98.71% ，RSD为1.38%。该方法简便、稳定、重现性好，为海棠果的开发利用奠定了一定基础。海棠果中含有丰富的总黄酮，平均含量达10.04%，具有较高的研究价值。

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(责任编辑：宋勇刚)

Determination Total Content of Flavonoids from Chinese Flowering Crabapple

Luo Yonghui, Zhang Cuixiang, Xu Chunping，Zuo Shaoyuan，Liu Yunchun

(Pre-clinical College，Dali University, Yunnan 671000, China)

Objective:To establish the method of determination the total content of flavonoids from Chinese flowering crabapple.Methods:Taking rutin as the standard sample and colored by NaNO2-Al(NO3)3-NaOH solution, the total content of flavonoids from Chinese flowering crabapple was determined by the spectrophotometric method.Results:The total content of flavonoids from Chinese flowering crabapple was 10.04%. The RSDs of the precision test, the stability test and the repetitive test were 0.78% , 2.30% and 0.69% respectively. There was a better linear relation with the concentration of rutin standard in the range of 0～100μg/mL. The regression equation wasY=0.010 9X-0.001 2, and the square of correlation coefficient R2=0.9998. The average recovery rate was 98.71% (RSD=1.38%).Conclusion:The method is simple and stable, and may be used to determine the total content of flavonoids from Chinese flowering crabapple.

Chinese Flowering Crabapple; Total Flavonoids; Rutin; Content Determination

2014-01-07

罗永会(1967-)，女，白族，大理学院基础医学院实验师，研究方向为生物化学实验教学和植物成分的提取。

R284.2

A

1673-2197(2014)09-0020-03