改良抗酸染色法在结核性脑膜炎诊断中的应用

邹月丽 白鸽 卜晖 王蓓蕾 田亚楠 钱丽花 王莎 何俊瑛

改良抗酸染色法在结核性脑膜炎诊断中的应用

邹月丽*白鸽*卜晖*王蓓蕾*田亚楠*钱丽花*王莎*何俊瑛*

目的 探讨改良抗酸染色法在结核性脑膜炎诊断中的应用。方法采用改良抗酸染色法对35例结核性脑膜炎患者脑脊液进行涂片、染色及镜检。结果35例患者中改良抗酸染色法阳性33例（94.29%），其中有53.40%的标本找到胞内抗酸杆菌；非结核性脑膜炎者15例，其中有1例改良抗酸染色结果阳性。结论改良的抗酸染色法显著提高了脑脊液抗酸杆菌的检出率，并能发现细胞内抗酸杆菌。因此，改良抗酸染色法可作为早期诊断结核性脑膜炎的有效检测手段。

结核性脑膜炎 改良抗酸染色法 脑脊液

结核性脑膜炎（简称结脑）是结核病中受结核杆菌破坏最严重的形式之一，常导致高致残率及死亡率。故早期诊断并及时给予抗痨药物治疗对于改善结脑的预后至关重要。但是至今临床上仍然缺乏有效的诊断方法[1]，这就严重影响了结脑患者的治疗及预后，同时制约了实验室对结脑的更进一步研究。现有的方法中，脑脊液(cerebrospinal fluid,CSF)结核杆菌培养耗时长、需要的脑脊液量大、检测阳性率很低[2-3]。脑脊液结核杆菌PCR虽然是一种快速敏感性高的检测方法，但假阳性率高是这种检测方法尚无广泛应用于临床的重要原因。脑脊液涂片找抗酸杆菌（acid-fast bacilli，AFB）仍是目前用于诊断结脑最常用的的一种简便迅速方法，但传统的抗酸染色法(Ziehl-Neelsen stain,Z-N)阳性率极低，据报道国内外传统抗酸染色阳性率在10%左右[4-5]。所以，现在急需一种能从少量脑脊液中快速、高敏感的找到结核分枝杆菌的方法，为临床结脑诊治及结脑实验研究提供依据，因此我们将128人份脑脊液涂片进行改良抗酸染色法，对镜检结果进行分析，探讨改良的抗酸染色法对结脑诊断及治疗中的价值。

1 资料与方法

1.1 研究对象收集2012年5月至2012年10月河北医科大学第二医院神经内科收治的50例临床怀疑为中枢神经系统感染的患者，共128人份脑脊液。50例患者中，男31例，女19例，年龄18～81岁，平均（35±6）岁。就诊离发病时间1～56 d，7 d以内就诊的有14例；7～30 d的有27例；＞30 d就诊的有9例。入院后50例患者均严格按照临床诊断标准进行规范诊治。结脑组临床诊断标准参考Ahuja等[6-7]临床诊断标准：①临床表现有发热、头痛、呕吐，持续时间大于5 d，脑膜刺激征或伴有局灶性神经损害，伴或不伴结核感染的全身中毒症状；②脑脊液检查显示细胞数增加(10～500/μL)，淋巴细胞比例＞50%，蛋白＞1 g/L，葡萄糖＜血糖的50%（即＜2.2mmol/L），阿利新兰染色未见隐球菌及细菌培养阴性；③头颅CT或MRI检查存在脑基底池渗出、脑积水、梗死灶或结核瘤等表现；④存在颅外结核如肺结核；⑤除外其他神经科疾病。满足以上①⑤和②③④中任意两项即可诊断为结脑。非结脑组诊断标准参考人民卫生出版社第五版《神经病学》，其中包括脑膜白血病、化脓性脑膜炎及脑膜癌病。

1.2 研究方法用改良抗酸染色法[8]对所有结脑患者的脑脊液涂片进行染色，即细胞离心机（Shandon Cytospin,Therm-4,英国）进行集菌、4%多聚甲醛固定、TritonX-100破膜、用传统抗酸染色剂(天和，杭州)进行染色、最后用光学显微镜（OLYMPUS-BX41,日本）进行镜检。阅片结果完全按照国际上公认的修改后的国家结核病公职规划(RNTCP)指南进行统计，将镜检结果共划分为5个等级：-即100个视野内未见AFB；±即100个视野内可见1～10条AFB；+即100个视野内可见10～100条AFB；++即每个视野内可见1～10条AFB；+++即每个视野内可见大于10条AFB。我们将结果为＜（+）者均定为抗酸染色阴性。

1.3 统计学方法采用SPSS13.0对数据进行分析，计量资料表示用（±s），两组间率的比较用χ2检验，两组计量资料均数的比较用t检验，检验水准为α=0.05有统计学意义。

2 结果

2.1 临床资料按Ahuja等[9]临床诊断标准，诊断为结脑者35例，非结脑者15例，其中脑膜白血病5例，新型隐球菌性脑膜炎5例，化脓性脑膜炎5例。诊断为结脑的患者均给予规律的3～5联抗结核治疗。35例患者经抗结核治疗后34例（97.14%）症状和体征有不同程度的好转，其中症状明显好转者26例（74.29%），出院后基本无明显神经系统阳性体征；症状改善者8例（22.86%），出院后仍遗留有不同程度神经系统体征；死亡1例（2.86%），死于结脑的并发症(脑疝)。

2.2 改良抗酸染色结果光镜下，抗酸杆菌呈散在、并列或成堆分布，治疗前或治疗初的形态多为细长略弯曲、线条柔；治疗后菌体变为粗短杆状、大小颗粒，线条不再柔和。抗酸杆菌多为胞外菌，也可见大量胞内抗酸杆菌，吞噬菌体的细胞主要为中性粒细胞，也可见到淋巴及单核细胞，胞内菌多为粗短杆状菌，少数菌形态为细长略弯曲（图1）。

35例结脑患者中，首次腰穿改良抗酸染色阳性者共31例，占88.57%。结脑组及非结脑组患者抗酸染色结果，见表1。细胞内抗酸染色检测结果见表2。

在抗酸结果为（+++）的6例中5例脑脊液中性粒细胞比例最高达到60%以上，另外1例中性粒细胞比例最高只达到4%；抗酸结果为（++）的16例病人脑脊液细胞中中性粒细胞比例最高值的中位数（M）53.5%，四分位间距（QR）71%,抗酸结果为（+）的12例患者的脑脊液细胞中中性粒细胞比例最高值的M63%，QR72%。抗酸结果为（±）或（1-）的2例患者，脑脊液细胞学中中性粒细胞比例在整个发病过程中最高为1%（图2）。35例结脑患者其中有8例患者一直随访至痊愈，8例患者抗酸阳性持续时间为病程的第(10～50)d，M为27d（图3）；其他患者正在随访中，最长已随访至病程第195d，改良抗酸染色仍阳性。

非结脑组（共15例）中阴性者共14人，占93.33%：其中1人（++）（表1）。

3 讨论

图1 改良抗酸染色法的阳性结果（抗酸染色×1000）图A和B为结脑患者在未治疗或治疗初的抗酸染色结果：抗酸杆菌形态细长略弯曲、线条柔和，少数菌呈分节状，可见分枝趋势，图C和D为胞内抗酸杆菌，菌体为粗短杆状，可见吞噬抗酸杆菌的细胞有中性粒细胞、单核细胞及淋巴细胞，图E和F显示的为经过治疗后的抗酸杆菌，菌体变为粗短杆状、线条不再柔和，菌体宽度不同程度的增宽及长度不同程度的缩短

图2 结脑组病人脑脊液中性粒细胞比例最高值分布表

结核性脑膜炎发病率持高不下，从脑脊液中找到结核分枝杆菌为诊断结脑的“金标准”。抗酸涂片染色在临床上应用最广泛，但由于结核分支杆菌菌体内含有大量类脂质，占结核菌干重的60%，细胞壁内含量最多，且其富脂外壁的疏水性之故，一般的染色剂难以渗入，对外界条件有异常大的抵抗力；此外，脑脊液中含菌量极少，故使传统的抗酸染色法阳性率极低，远远不能满足临床结脑诊断的要求。本文针对此难题，将传统抗酸染色法进行改良，旨在提高抗酸染色的检出率，并能检出胞内抗酸杆菌。

表1 改良抗酸染色的结果

表2：胞内抗酸杆菌结果

本研究主要从以下两方面进行。首先，结核分枝杆菌为兼性胞内菌，即既有细胞外状态又有细胞内状态，故为提高胞外结核杆菌的检出率，并同时检出胞内菌，我们将传统的试管离心法4000 r/min 20～30min的离心条件进行改变，采用细胞收集法，并将离心力及时间适度缩减，使采用少量脑脊液即可将结核杆菌均匀的收集载玻片上，并保证了细胞的完整性，以至于可以检出已被吞噬到细胞内的胞内菌。其次，针对结核杆菌的细胞壁富含脂质，TritonX-100是一种非离子型表面活性剂，通过它溶解脂质，增加细胞壁对染色剂的通透性，提高染色的阳性率，故先用TritonX-100在染色之前对标本进行预处理，预处理之后进行抗酸染色。本文中的改良抗酸染色法将抗酸染色的检出率由以往的10%提高至88.57%，若在整个病程中多次腰穿行改良抗酸染色法，可将检出率提高至94.29%。同时改善了传统方法不能检出胞内菌的窘况，在检出抗酸杆菌的标本中，53.15%的标本均检出胞内抗酸杆菌，Chen等[8]也报道过同样的结果，他们对48份结脑患者的脑脊液进行改良抗酸染色，用特异性荧光染料分别对抗酸杆菌、中性粒细胞、单核细胞及淋巴细胞进行标记，通过激光共聚焦显微镜进行扫描立体定位，发现三种细胞均吞噬了抗酸杆菌的现象。传统抗酸染色法往往在患者接受抗痨治疗后1周就不能检出抗酸杆菌，本文中的此种改良抗酸染色法检出抗酸杆菌的时间延长至27 d左右，最长的为患者在接受抗痨治疗6个半月时脑脊液中仍能检出抗酸杆菌。因此，将细胞离心法与TritonX-100破膜技术相结合，明显提高了胞外抗酸杆菌的检出率,也能检出胞内抗酸杆菌，并可将抗酸杆菌的检出时间延长。

抗酸的阳性程度可能与脑脊液中中性粒细胞的比例关系密切，Marzia等[10]分析了22例结脑患者脑脊液中中性粒细胞比例与CSF结核杆菌培养阳性的关系,此22例患者脑脊液结核杆菌培养均阳性，其中有94%的患者脑脊液细胞学是以嗜中性粒细胞为主，提出嗜中性粒细胞比例的增高与结核杆菌的存在有密切关系。本实验中抗酸结果（+++）的6例患者中有5例患者脑脊液中性粒细胞的最高值均达到60%以上。

总之，改良抗酸染色法明显提高了脑脊液中抗酸杆菌的检出率，既能检出细胞外抗酸杆菌也可检出胞内抗酸杆菌，并延长了检出抗酸杆菌的时间。但我们仍有不足之处。首先，改良抗酸染色法检出的只为抗酸杆菌，不能确定为结核分枝杆菌，也不能证明此菌是致病状态还是潜伏感染状态，故仍需做进一步研究来证实抗酸杆菌为致病性结核分枝杆菌；其次，本组资料非结脑组中有1例改良抗酸染色阳性，考虑原因为该例患者为新型隐球菌性脑膜炎，在首次腰穿送检脑脊液细胞学后发现大量新型隐球菌，故临床诊断为新型隐球菌性脑膜炎，并未考虑合并其他感染的可能，而新型隐球菌性脑膜炎患者大多是在机体免疫功能较差的条件下感染的，因此可能也会增加结核感染的机会，故此例患者可能同时合并结核杆菌的感染。另外，目前鲜有文献报道淋巴细胞的吞噬功能，故尚需不断研究来解释淋巴细胞吞噬的原理。

[1] Thwaites GE.Advances in the diagnosis and treatment of tuberculousmeningitis[J].Curr Opin Neruol,2013,26(3):295-300.

[2] Ho J,Marais BJ,Gilbert GL,et al.Diagnosing tuberculousmeningitis-have we made any progress[J].Trop Med Int Health, 2013,18(6):783-793.

[3] 王婷,冯国栋,赵雁林,等.结核性脑膜炎临床和实验室诊断现状与新进展[J].中华神经科杂志,2013,46(10):706-709.

[4] Trusov A,Bumgarner R,Valijev R,et al.Comparison of Lumin LED fluorescent attachment,fluorescentmicroscopy and Ziehl-Neelsen for AFB diagnosis[J].Int JTuberc Lung Dis,2009,13: 836-841.

[5] Ulrichs T,Lefmann M,Reich M,et al.Modified immunohistological staining allows detection of Ziehl-Neelsen-negative Mycobacterium tuberculosis organisms and their precise localization in human tissue[J].JPathol,2005,205:633-640.

[6] Ahuja GK，Mohan KK，Prasad K，et al.Diagnostic criteria for tuberculousmeningitis and their validation[J].Tuber Lung Dis, 1994,75:149-152.

[7] Marais S,Thwaites G,Schoeman JF,etal.Tuberculousmeningitis:a uniform case definition for use in clinical research[J].Lancet Infect.Dis,2010,10:803-812.

[8] Chen P,Shi M,Feng GD,et al.A highly efficient Ziehl-Neelsen stain:identifying de novo intracellular mycobacterium teberculosis and improving detecion of extracellular M.tuberculosis in cerebrospinal fluid[J].JClin Microbiol,2012,50:1166-1170.

[9] Ahuja GK，Mohan KK,Prasad K,et al.Diagnostic criteria for tuberculousmeningitis and their validation[J].Tuber Lung Dis. 1994,75(21):49-152.

[10] Puccioni-sohler M,Brandao CO.Factors associated to the positive cerebrospinal fluid culture in tuberculous meningitis[J]. Arq Neuropsiquiatr,2007,65:48-53.

Evaluation on a modified Ziehl-Neelsen stainin the diagnosis of tuberculous meningitis.

ZOU Yueli,BAI Ge, PU Hui,WANG Beilei,TIAN Yanan,QIAN Lihua,WANG Sha,HE Junying.
Department of Neurology,the Second Hospital of HebeiMedical University,Shijiazhuang 050000,China.Tel:0311-66003711-211.

ObjectiveToevaluateamodified Ziehl-Neelsen(Z-N)stain in the diagnosis of tuberculousmeningitis.MethodsCerebrospinal fluid specimens from 35 patientswere stained by using themodified Ziehl-Neelsen staining.ResultsThe positive rate was 94.29%in 35 patients with tuberculousmeningitisand the intracellular acid-fast bacilliwas detected in 53.40% of all specimens.One casewas stained positive in 15 patients with non-tuberculousmeningitis.ConclusionThemodified Ziehl-Neelsen stain notonly significantly improves the detection rates of tuberculousmeningitisbut alsois able to identify intracellular M.tuberculosisin cerebrospinal fluidspecimen.Thus,themodified Z-N stain can be a convenient tool for diagnosing tuberculousmeningitis.

Tuberculousmeningitis Modified Ziehl-Neelsen stain Cerebrospinal fluid

R529.3

A

2013-01-08）

（责任编辑：李立）

10.3936/j.issn.1002-0152.2014.03.005

*河北医科大学第二医院神经内科(石家庄 050000)