负载辐射凋亡MB49肿瘤细胞抗原的树突状细胞（DC）疫苗对小鼠膀胱癌的抑制作用

谢雪锋 侯剑刚陈 刚丁 强

(1复旦大学附属金山医院泌尿科 上海 201508；2复旦大学附属华山医院泌尿外科研究所 上海 200040)

负载辐射凋亡MB49肿瘤细胞抗原的树突状细胞（DC）疫苗对小鼠膀胱癌的抑制作用

谢雪锋 侯剑刚2△陈 刚1丁 强2

(1复旦大学附属金山医院泌尿科 上海 201508；2复旦大学附属华山医院泌尿外科研究所 上海 200040)

目的研究辐射凋亡MB49肿瘤细胞诱导的树突状细胞(dendritic cell,DC)疫苗的制备及对C57BL/6小鼠体内膀胱肿瘤的免疫学效应。方法采用辐射法获取MB49细胞抗原并用其致敏骨髓来源的DC来制备DC疫苗。用MB49小鼠膀胱癌细胞建立荷瘤动物模型,随机分为实验组和对照组,于肿瘤细胞接种后第7、14天给予相应DC疫苗治疗或者PBS,每组分为2个亚组,分别用于测量瘤质量、体积及用于观察荷瘤小鼠存活情况。结果

树突状细胞(DC)； 膀胱肿瘤； 疫苗； MB49细胞； 小鼠

树突状细胞(dendritic cell,DC)是目前发现最强大的抗原提呈细胞(antigen presenting cell, APC),能有效激发T细胞应答并诱导特异性细胞

毒性T淋巴细胞(cytotoxicity T lymphocyte,CTL)生成。在我国,膀胱肿瘤是泌尿系统最常见的恶性肿瘤,发病率居全身肿瘤的第5位,其中移行细胞癌占95%。利用DC疫苗接种宿主,诱导或增强宿主防御功能,提高机体免疫系统对肿瘤的特异杀伤能力,已成为晚期膀胱癌免疫治疗中的研究热点。

材料和方法

细胞培养MB49细胞来源于通过致癌物诱发C57BL/6雌性小鼠的膀胱移行细胞癌(复旦大学华山医院泌尿外科研究所提供)。细胞培养液为10%胎牛血清、1%盘尼西林/链霉素及含0.1%丙酸钠的RPMI-1640培养液。细胞在5%CO2、37℃培养箱中培养。

实验动物采用C57BL/6雌性小鼠,4～6周龄,体质量17～20 g,饲养在SPF级动物房中。

骨髓来源DC的制备及鉴定DC细胞提取方法主要参照Inaba的方法。取6周龄健康雌性SPF级C57BL/6小鼠,处死后取胫骨和股骨,1 m L注射器抽取无菌预冷PBS冲洗骨髓腔；经200孔单细胞过滤钢筛过滤,收集滤液,161×g离心5 min,弃上清；加40 g/L的Tris-NH4Cl溶液1 m L重悬细胞团,反应2 min,161×g离心5 min,去除裂解之红细胞,弃上清,PBS洗涤2次,每次5 min。细胞团重悬于含体积分数10%胎牛血清的RPMI-1640培养液中,使细胞密度达到1.5×106/m L转移至6孔培养板内,每孔2 m L,培养24 h后,PBS洗涤2次,去除未贴壁细胞,换用含重组小鼠粒-巨噬细胞集落刺激因子(10μg/L)和重组小鼠IL-4(5μg/L)的RPMI-1640完全培养液继续培养。

采用流式细胞仪鉴定细胞。将收集的细胞(密度5×105/m L)置于含2μg单抗(CD11c-APC、CD11b-PE、CDI-A-PE、CD80-PE、CD46-PE)的BSA-PBS中,4℃孵育30 min,PBS洗涤2次,加FITC荧光标记的羊抗大鼠IgG,4℃孵育30 min, PBS洗涤2次,重悬于含1%多聚甲醛的PBS中,进行流式细胞仪(FACS Becton-Dickenson)检测。

肿瘤细胞的照射和凋亡测定为了获得凋亡的肿瘤细胞,我们收集了培养中的MB49细胞,制成密度为1×107/m L的单细胞悬液,然后用100 Gy X线照射(Faxitron CP-160)［1］。经过照射的细胞用不含胎牛血清的RPMI-1640培养,每天通过Annexin V-FITC和PI染色后利用流式细胞仪测定凋亡细胞的比例。

肿瘤细胞抗原的负载经过照射的MB49细胞用不含胎牛血清的RPMI-1640培养3天,以1∶1的比例和密度为1×106/mL的未成熟DC混合培养24 h于实验组。对照组用LPS刺激的未成熟DC细胞。

DC疫苗的保护作用研究C57BL/6雌性小鼠40只,随机分为4组,分别皮下注射PBS、未成熟DC细胞(im-DC)、LPS促熟的DC(LPS-DC)及经过照射含有凋亡MB49细胞共同培养的DC细胞(MB49-DC)。7天后再重复接种1次。第2次接种的7天后,皮下接种MB49肿瘤细胞。每组分为2个亚组,分别测量肿瘤体积,并观察荷瘤小鼠的存活情况。

数据分析采用SPSS 10.0软件。计量数据以x—±s表示,组间比较采用t检验,P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

通过体外培养可以获得大量DC细胞骨髓来源的干细胞可以被诱导分化成具有免疫效应的DC。为了研究负载肿瘤抗原诱导的免疫反应,需要足够量的处于同一成熟水平的DC细胞。我们首先在培养液中加入IL-4和GM-CSF,以体外扩增小鼠骨髓来源的干细胞(图1)。扩增到第5天,检测表面抗体显示CD11c高表达,但是CD80、CD86及I-A低表达,提示为未成熟DC细胞。加入LPS共同培养后第7天,检测CD80、CD86及I-A,提示为DC细胞成熟(图2)。

X线照射后获得凋亡的肿瘤细胞为了获得最佳的凋亡细胞数,每天用流式细胞仪测定经过照射并用无血清培养液培养的肿瘤细胞,结果显示在第3天细胞凋亡达到最佳数目(图3)。

凋亡肿瘤细胞和未成熟DC细胞共培养获得成熟DC细胞培养至第5天的未成熟DC和经照射及无血清培养的DC共培养1天后,流式细胞测定显示成为成熟DC细胞(图4)。

DC疫苗的保护作用为了检测负载了特殊肿瘤抗原的DC细胞是否具有疫苗功能,我们进行了皮下肿瘤模型［1］的抑制实验。单纯注射PBS后,肿瘤生长速度快,且小鼠很快出现死亡；注射未成熟DC及LPS-DC后,肿瘤生长速度有所减慢,但最终也导致小鼠全部死亡(图5)；注射MB49-DC后,肿瘤生长速度缓慢,且有2只小鼠出现无瘤存活(图6)。

讨 论

DC是目前所知功能最强的抗原提呈细胞,DC可在其分布位置上捕获、加工抗原,迁移到淋巴器官中激活T淋巴细胞,尤其是初始T细胞(naive T cells)和静息T细胞(resting T cells)。T淋巴细胞介导的细胞免疫特别是CTL在机体抗肿瘤和抗感染中起到重要作用［2］,利用负载相关抗原的DC作为疫苗进行肿瘤生物治疗大有前景［3］。大量实验证实,用不同形式的肿瘤抗原体外冲击致敏DC后,可以产生较强的抗肿瘤免疫,并能抑制肿瘤生长和转移,目前一些体内和临床试验仍在进行中［4-5］。在对肿瘤疫苗的探索中,研究人员采用多种策略研制DC瘤苗,以激发抗肿瘤特异性免疫应答,主要包括负载肿瘤抗原的DC、肿瘤抗原致敏的DC和肿瘤抗原基因转染的DC等［6］。用肿瘤细胞裂解物致敏的DC疫苗能诱导有效的CTL反应,裂解肿瘤细胞,并能分泌高水平的干扰素γ(interferon,IFN)［7］。然而,细胞性抗原因含有多种非肿瘤相关抗原且抗原性差。而全细胞性抗原具有多种抗原表位,可诱导针对不同抗原决定簇的CTL克隆,更有利于对肿瘤细胞的免疫攻击。Fry等［8］研究表明,相对于其他方法,肿瘤细胞经过照射后导致细胞凋亡,并与未成熟DC共同培养,未成熟DC可以吞噬凋亡体,并摄取、加工和提呈肿瘤抗原,从而能极大地提高DC的抗肿瘤活性。Hoffmann等［9］认为,使用凋亡细胞比使用裂解物对产生自体CD8+CTL更有效。

我们的研究提示,通过体外培养可以获得大量高质量的DC,为DC治疗提供了可能性。但是未成熟DC不具有疫苗作用而达不到治疗效果。利用LPS诱导的成熟DC因为没有呈递肿瘤抗原,同样没有疫苗作用。

经过射线照射后的肿瘤细胞可以检测到大量凋亡细胞。一方面,射线利用其穿透力,使肿瘤细胞内部发生电离效应,破坏其DNA结构,抑制或杀死肿瘤细胞；另一方面,射线通过诱导肿瘤细胞释放HMGB-1、HSP70等内源性“危险信号”而提高肿瘤细胞的免疫原性,同时会上调MHC-1和ICAM-1、VCAM-1等黏附分子的表达,进而趋化免疫细胞,并激活宿主固有免疫应答甚至适应性免疫应答。凋亡的肿瘤细胞可作为抗原信号诱导特异性免疫反应。另外,DC吞噬凋亡细胞后出现成熟反应,上调趋化因子、细胞因子和共刺激分子。Albert等［10］认为,DC与凋亡细胞共孵育可产生肿瘤特异性CTL,而坏死细胞不可以。

我们的实验提示,经射线照射后肿瘤细胞中可检测到大量调亡细胞,其与未成熟DC共孵育后,可以产生高纯度的成熟DC,利用调亡的肿瘤细胞诱导的成熟DC具有疫苗作用。本研究表明,负载辐射凋亡肿瘤细胞的DC疫苗对C57BL/6小鼠膀胱肿瘤具有肿瘤抑制效应,并能延长小鼠生存期。

［1］ 侯剑刚,徐可,方祖军,等.应用MB49细胞建立三种膀胱癌模型［J］.中华实验外科杂志,2010,27(6)：840-841.

［2］ Morel PA,Turner MS.Designing the optimal vaccine：the importance of cytokines and dendritic cells［J］.Open Vaccine J,2010,3：7-17.

［3］ Koido S,Homma S,Hara E,et al.Regulation of tumor immunity by tumor/dendritic cell fusions［J］.Clin Dev Immunol,2010：516768.

［4］ von Euw EM,Barrio MM,Furman D,et al.A phase I clinical study of vaccination of melanoma patients with dendritic cells loaded with allogeneic apoptotic/necrotic melanoma cells.Analysis of toxicity and immune response to the vaccine and of IL-10-1082 promoter genotype as predictor of disease progression［J］.J Transl Med,2008, 6：6.

［5］ Steinman RM,Pope M.Exploiting dendritic cells to improve vaccine efficacy［J］.Clin Invest,2002,109(12)：1519-1526.

［6］ Yanofsky VR,Mitsui H,Felsen D,et al.Understanding dendritic cells and their role in cutaneous carcinoma and cancer immunotherapy［J］.Clin Dev Immunol, 2013：624123.

［7］ Li YL,Wu YG,Wang YQ,et al.Bone marrow-derived dendritic cells pulsed with tumor lysates induce anti-tumor immunity against gastric cancer ex vivo［J］.World J Gastroenterol,2008,14(46)：7127-7132.

［8］ Fry TJ,Shand JL,Milliron M,et al.Antigen loading of DCs with irradiated apoptotic tumor cells induces improved anti-tumor immunity compared to other approaches［J］.Cancer Immunol Immunother,2009,58 (8)：1257-1264.

［9］ Hoffmann TK,Meidenbauer N,Dworacki G,et al. Generation of tumor-specific T-lymphocytes by crosspriming with human dendritic cells ingesting apoptotic tumor cells［J］.Cancer Res,2000,60(13)：3542-3549.

［10］ Albert ML,Jegathesan M,Darnell RB.Dendritic cell maturation is required for the cross-tolerization of CD8+ T cells［J］.Nat Immunol,2001,2(11)：1010-1017.

Inhibitory effects of dendritic cell（DC）vaccine loading antigen with irradiated apoptotic MB49 tumor cells against bladder cancer cells in mice

XIE Xue-feng1,HOU Jian-gang2△,CHEN Gang1,DING Qiang2
(1Department of Urology,Jinshan Hospital,Fudan University,Shanghai 201508,China；
2Institute of Urology,Huashan Hospital,Fudan University,Shanghai 200040,China)

Objective To investigate the effects of dendritic cell(DC)vaccine sensitized by antigen with irradiated apoptotic MB49 tumor cells on the treatment of bladder cancer in mice.MethodsMB49 antigen was obtained by irradiation and then sensitized bone marrow derived DC(BM-DC)to establish DC vaccine. Mice bearing bladder cancer were divided into DC group and control group.On the 7thand 14thday after subcutaneous of tumor cell,DC group was injected DC vaccine,and the control group was injected PBS.Each group was divided into two subgroups in order to measure tumor mass and volume and to observe survival condition of mice.ResultsThe average mass and volume of tumors in mice of DC group were significantly higher than those of the control group(P＜0.01),which also had longer survival period.Two mice in DC group survived without tumor for 30 days.Although they were injected MB49 cells for the second time,there was no tumor growth in 30 days.ConclusionsDC vaccine loading antigen with irradiated apoptotic MB49 tumor cells can inhibit the growth of MB49 cells in vivo.

dendritic cell(DC)； bladder tumor； vaccine； MB49 cells； mice

R 737.14

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2014.01.014

2013-03-28；编辑：王蔚)

△Corresponding author E-mail：hou_jiangang@hotmail.com

负载辐射凋亡肿瘤细胞DC疫苗的实验组荷瘤小鼠,其肿瘤的平均体积和平均质量均显著低于对照组(P＜0.01),生存期长于对照组。DC疫苗实验组中有2只小鼠30天内无肿瘤生长,再次皮下接种MB49细胞观察30天仍无肿瘤发生。结论负载辐射凋亡肿瘤细胞的DC疫苗对膀胱肿瘤荷瘤小鼠具有抑瘤效应和延长生存期的作用。