促红细胞生成素（Ep O）对叶酸在Caco-2细胞中跨膜转运的影响

言君凯靳桂英李豪男杨青△

(1复旦大学生命科学学院生物化学系 上海 200433；2金日成综合大学生命科学系 平壤)

促红细胞生成素（Ep O）对叶酸在Caco-2细胞中跨膜转运的影响

言君凯1靳桂英1李豪男2杨青1△

(1复旦大学生命科学学院生物化学系 上海 200433；2金日成综合大学生命科学系 平壤)

目的采用人结肠腺癌细胞系(human colon adenocarcinoma cell line)Caco-2单细胞层模型观察促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)对叶酸跨膜转运的影响。方法采用Caco-2单层细胞模型,观察不同剂量EPO(0.3、1、3 U/m L)处理对叶酸在摄取与外排双向转运方面的影响。通过real time-PCR与Western blot观察EPO处理对质子偶联的叶酸转运体(proton coupled folate transporter,PCFT)、还原叶酸载体(reduced folate carrier,RFC)以及多药耐药相关蛋白2(multidrug resistance-associated protein 2,MRP2)表达的影响。结果EPO在剂量0.3～3 U/m L范围内可剂量依赖地增加叶酸在摄取方向的转运,增幅分别为31.6%、61.5%和120.5%。高剂量EPO(3 U/mL)对叶酸在外排方向的转运也具有促进作用,增幅为56.9%,而中低剂量EPO (1、0.3 U/m L)对叶酸外排无明显作用。叶酸转运体PCFT、RFC及MRP2均受EPO影响而表达上调,并呈剂量依赖和时间依赖关系。结论EPO可上调叶酸的摄取并呈剂量依赖关系,高剂量EPO对叶酸的摄取与外排具有双向促进作用。

叶酸； 促红细胞生成素(EPO)； Caco-2细胞； 叶酸转运体

促红细胞生成素(erythropoietinm,EPO)是临床上治疗肾性贫血的经典药物,其发挥作用的主要机制是在骨髓内刺激造血细胞的分化成熟［1］。自20世纪90年代初EPO开始用于治疗肾性贫血以来,其极大地改善了患者的预后情况和生存质量。随着时间的推移,EPO治疗的个体差异性越发受到关注。有文献指出,在某些患者体内铁、叶酸等造血营养素的代谢水平是影响EPO疗效的重要因素之一［2-3］。鉴于这些造血营养素不能为人体自身合成且只能由外源性食物供给,口服吸收便成为整个代谢过程中的关键［4］。近年的研究发现,EPO具有调控体内铁代谢的功能［5-6］,它可直接促进铁的口服吸收［7］,但是叶酸的口服吸收是否也受到EPO调控仍不得而知。

基于叶酸的吸收主要在肠道进行,涉及的转运体包括还原叶酸载体(reduced folate carrier, RFC)［8-9］、质子偶联的叶酸转运体(proton coupled folate transporter,PCFT)［10-11］及多药耐药相关蛋白2(multidrug resistance-associated protein 2, MRP2)［12］。RFC与PCFT负责将叶酸从肠腔摄取转运至血浆,而MRP2则将叶酸从血浆外排回肠腔［4］。动物实验显示体内EPO水平与叶酸吸收之间存在联系。在先天叶酸吸收不良(hereditary folate malabsorption,HFM)的小鼠模型中,其血清EPO水平相对较高,提示EPO增高可能与机体对叶酸吸收不良的代偿有关［13］。内源性EPO多由肾脏分泌,在5/6肾脏切除的小鼠模型中,动物肠道内叶酸转运体PCFT与RFC均有下调,考虑可能因EPO分泌不足所致［14］。因此,我们提出假设,EPO对叶酸的肠道吸收具有一定调控作用,且可能与叶酸转运体蛋白表达的变化有关。

人结肠腺癌细胞系(human colon adenocarcinoma cell line)Caco-2来源于人类结肠和直肠癌细胞,其在形态学、标志酶的功能表达及渗透性等方面与小肠上皮细胞相似。药物透过Caco-2细胞单层的体外过程与药物口服后在肠中的吸收和代谢有良好的相关性,因此Caco-2细胞成为研究药物吸收、转运和代谢最经典的体外细胞模型之一［15］。该细胞模型在涉及叶酸吸收与EPO作用的研究中均有应用［7,16-17］,是体外研究EPO影响叶酸吸收的理想工具。

综上所述,本实验拟采用Caco-2单层细胞模型观察EPO对叶酸肠道吸收的影响,以期对拓宽EPO作用机制的认识、深化了解肾性贫血患者体内的病理生理改变有所帮助。

材料和方法

药品与试剂叶酸标准品(98%HPLC,美国Sigma公司)；促红细胞生成素(3 000 U,上海市第九人民医院)；DMEM培养基、非必需氨基酸、青-链霉素和0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA(美国Gibco公司)；胎牛血清(杭州四季青生物技术有限公司)。HPLC所用的乙腈及甲醇均为色谱纯级别。

设备和仪器安捷伦1260高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；伯乐IQ5实时定量PCR(美国Bio-Rad公司)；Typhoon FLA9000(美国GE Healthcare公司)；24孔Transwell(底面积0.6 cm2,孔径0.45μm)、跨膜电阻仪(美国Millipore公司)。

细胞培养Caco-2细胞株来源于ATCC(HTB-37),采用DMEM高糖培养基(含10%胎牛血清、1%非必需氨基酸、0.1%青-链霉素)于37℃、5% CO2培养箱中培养(相对湿度90%)。待细胞生长至80%～90%汇合时,用PBS冲洗2～3次,用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化,按1∶5传代。用于转运实验的细胞按5×104/孔的密度接种至Transwell,隔天换液,连续培养21～23天,满足跨膜电阻大于300Ω·cm2的膜用于叶酸转运实验。

EpO处理转运实验前48 h,移去Transwell小室内培养基,用PBS冲洗2～3次,在EPO处理组细胞的顶端侧(apical side,AP)加入400μL空白无血清培养基,在细胞的基底侧(basolateral side, BL)加入600μL含EPO(0.3、1、3 U/m L)的无血清培养基,对照组细胞AP侧与BL侧均替换成空白无血清培养基,继续培养48 h后用于后续实验。

叶酸转运试验用PBS配制浓度为10μmol/L的叶酸标准品溶液并调节p H至6.0或7.4,分别用于AP→BL的吸收方向和BL→AP的外排方向的转运实验。AP→BL转运：AP侧加入400μL叶酸标品(p H 6.0),BL侧加入600μL空白PBS(p H 7.4)；BL→AP转运：BL侧加入600μL叶酸标品(p H 7.4),AP侧加入400μL空白PBS(p H 6.0)。Transwell培养板置于37℃、60 r/min的水浴恒温振荡器中,在30、60、90、120 min时分别取样100 μL待检,并补加相应空白PBS。

HpLC法检测样品中叶酸含量于相应时间点取100μL待测样品,9391×g离心10 min,取上清过滤后用高效液相色谱仪测定叶酸含量。色谱条件：Agilent C18柱(4.6 mm×250 mm,5μm),柱温25℃；检测波长280 nm,流动相50 mmol/L磷酸二氢钾溶液(p H 6.3)∶乙腈(95∶5),流速1.0 mL/min,进样量80μL。

数据处理根据文献计算叶酸透过Caco-2细胞单层的表观渗透系数(apparent permeability coefficients,Papp)［18］,线性条件下参考公式1,非线性条件下参考公式2。

公式1：Papp=(d Q/d t)/(A×C0)。其中,d Q/ d t为药物渗透速率；A为膜面积(0.6 cm2)；C0是叶酸在供给侧的初浓度(10μmol/L)。

公式2：CR(t)=［M/(VD+VR)］+［CR(0)-(M/ (VD+VR)］e-Papp A(1/VD+1/VR)t。其中,VD是供给侧溶液体积(AP侧=400μL；BL侧=600μL),VR为接收侧溶液体积(AP侧=400μL；BL侧=600μL),A为膜面积(0.6 cm2),M为叶酸在转运体系中的总量,CR(0)为叶酸在初始时刻(t=0)接收侧的浓度, CR(t)为叶酸在t时刻接收侧的浓度。

realtime-pCR检测叶酸转运体mRNA表达将Caco-2细胞培养于12孔板内,待80%～90%汇合后进行EPO处理。EPO处理方式分3种：(1)观察EPO作用的剂量依赖关系：EPO处理剂量分低(0.3 U/m L)、中(1 U/m L)、高(3 U/m L)3组,处理时间48 h；(2)观察EPO作用的时间依赖关系：EPO处理剂量为1 U/m L,处理时间为4、24、48 h；(3)观察生理剂量下EPO的长期作用：EPO剂量为10 m U/m L,连续培养15天。采用Trizol法提取Caco-2细胞内总RNA。取1μg总RNA进行反转录,并使用SYBER Green法对目的基因进行相对定量,β-actin作为内参。PCR反应条件为：96℃预变性5 min,96℃变性1 min,56℃退火1 min, 72℃延伸1 min,反应循环35次。数据通过MyIQ软件分析,引物信息如表1所示。

Westernblot检测叶酸转运体蛋白表达将Caco-2细胞培养于6孔板内,待80%～90%汇合后进行EPO处理。EPO处理方式同上。采用文献报道方法提取膜蛋白［16］,经BCA法测定蛋白浓度后进行Western blot反应。SDS-PAGE(10%)电泳上样量为40μg,转膜,5%脱脂牛奶于室温下封闭2 h,加入PCFT一抗(1∶1 000,美国Abcam公司)、RFC一抗(1∶1 000,美国Abcam公司)、MRP2一抗(1∶1 000,美国CST公司),4℃过夜,经PBSTween(0.3%)洗膜后孵育,加入相应二抗并使用ECL PLUS试剂盒显色(美国GE Healthcare公司)。杂交信号由Typhoon FLA9000扫描,条带密度由Image Quant软件分析,以GAPDH作为内参,数据以目的蛋白/GAPDH比值表示。

统计分析所有数据以x—±s表示,重复3次以上。两组数据间用差异用t检验分析,P＜0.05为差异有统计学意义,统计分析使用SPSS 11.0统计软件。

结 果

EpO处理对叶酸转运的影响低、中、高3个剂量EPO(0.3、1、3 U/m L)处理Caco-2细胞后,对该方向上双向转运的变化见图1。在AP→BL摄取方向上,叶酸的转运量随时间呈非线性增长,90 min后逐渐趋于饱和,EPO处理上调了叶酸在该方向的转运并呈剂量依赖关系(图1 A)。对照组及EPO处理低、中、高3个剂量组在120 min时的累积转运量分别为(117.9±15.8)、(154.7±8.4)、(189.9± 6.8)和(258.0±7.6)pmol,EPO处理后的增幅分别为31.6%、61.5%和120.5%,中、高剂量EPO处理所致的差异有统计学意义(图1B)。在BL→AP外排方向上,叶酸的转运量随时间呈线性增长,低、中剂量EPO处理对该方向上的叶酸转运无明显影响,而高剂量EPO处理可上调叶酸转运(图1C)。对照组及EPO处理低、中、高3个剂量组在120 min时的累积转运量分别为(86.4±4.2)、(96.2±18.2)、(104.3±27.9)和(135.6±20.5)pmol,EPO处理后的增幅分别为11.3%、20.7%和56.9%,仅高剂量EPO所致差异有统计学意义(图1D)。在Papp方面,各时间点计算所得的结果如表2所示。在AP→BL吸收方向上,Papp值随时间变化逐渐减小,说明叶酸转运体在此过程中有逐渐饱和的趋势,同时Papp值也随EPO作用剂量的上升而逐渐增大,说明EPO处理对叶酸在该方向转运具有促进作用；在BL→AP外排方向上,Papp值随EPO作用剂量的上升而逐渐增大,说明EPO处理对叶酸在该方向转运同样具有一定促进作用。

表2 各时间点叶酸转运的pappTab 2 papp of Ap→BL or BL→Ap at each designed time point(±s)

Papp：Apparent permeability coefficients.

EpO处理对叶酸转运体mRNA表达水平的影响观察EPO处理Caco-2细胞后,内叶酸转运体PCFT、RFC和MRP2在m RNA水平的变化(图2)。EPO处理上调了PCFT与RFC基因的表达,呈现剂量依赖型(图2A),但仅中、高剂量EPO所致差异有统计学意义。MRP2基因表达仅在高剂量EPO处理时上调,低、中剂量EPO对MRP2 m RNA水平无明显影响；在时间依赖性试验中发现,PCFT与RFC mRNA水平的变化均在48 h时出现,且差异有统计学意义,24 h时出现的上调结果的差异未见统计学意义(图2B)。

EpO处理对叶酸转运体蛋白质表达水平的影响观察EPO处理Caco-2细胞后,叶酸转运体PCFT、RFC、MRP2蛋白质水平的变化(图3)。EPO处理可剂量依赖性地上调PCFT、RFC和 MRP2蛋白质水平(图3A),但仅中、高剂量EPO所致差异有统计学意义；在时间依赖性试验中发现, PCFT、RFC和MRP2蛋白质水平均在48 h时出现上调,且差异有统计学意义(图3B)。

生理剂量下EpO长期作用对叶酸转运体表达的影响进一步观察生理剂量下EPO(10 mU/mL)长期作用对叶酸转运体表达的影响(图4)。在mRNA水平上(图4A),96 h作用期间EPO处理组PCFT相对表达量(实线)及RFC相对表达量(虚线)与对照组的比值为80%～120%,差异无统计学意义；在蛋白质水平上(图4B),EPO处理组与对照组的PCFT、RFC表达在5、10及15天时差异均无统计学意义。

讨 论

叶酸、铁等微量营养素是造血过程中不可或缺的原料。近年来研究指出,EPO除了在骨髓内直接刺激造血细胞分化外,还具有调节铁吸收的作用,而叶酸的吸收是否也受EPO调控尚不明确。Caco-2细胞模型是体外研究营养素吸收的经典模型,因此本实验拟以Caco-2细胞为模型观察EPO对叶酸吸收和转运的影响。

在转运实验中,我们采用AP侧p H 6.0、BL侧p H 7.4的转运环境,是考虑到人体中肠道p H≈6,而血液p H≈7.4的实际情况。参考文献选择EPO的使用剂量［7］,低、中、高剂量分别为0.3、1和3 U/mL,与临床上治疗肾性贫血的实际用量相当。从结果中我们发现,叶酸在摄取方向和外排方向的转运均受EPO影响。在摄取方向上(AP→BL),EPO处理对叶酸转运具有促进作用并呈剂量依赖关系；在外排方向上(BL→AP),中低剂量EPO对叶酸转运虽无显著影响,但高剂量EPO处理对叶酸外排同样具有促进作用。因此,我们推测EPO纠正贫血的机制可能与其促进叶酸吸收、保证造血原料充足、优化造血环境有关；同时,高剂量EPO对叶酸转运的双向调控作用可能与EPO疗法的个体差异性有关。

肠道内负责叶酸转运的转运蛋白主要包括PCFT、RFC和MRP2,其中PCFT与RFC负责将叶酸从肠道AP侧转运至BL侧(摄取),而MRP2则负责将叶酸从BL侧转运至AP侧(外排)。我们在转运体表达的检测中发现,药理剂量下EPO (0.3、1、3 U/m L)处理48 h即可引起上述转运体表达的变化。其中,PCFT、RFC表达在EPO作用下剂量依赖上调,与转运实验中叶酸在摄取方向的变化一致。值得注意的是,中剂量EPO(1 U/m L)处理与高剂量EPO(3 U/m L)处理引起的PCFT、RFC表达的变化十分接近,但在转运实验中两者引起的变化程度却有较大差异,说明高剂量EPO (3 U/m L)影响下叶酸摄取的改变可能还有转运体表达之外的机制参与。MRP2表达同样在EPO作用下呈剂量依赖上调,但仅高剂量EPO(3 U/m L)引起叶酸在外排方向的改变,这可能与叶酸外排还有其他转运体参与介导有关。此外,我们发现转运体表达的变化在m RNA水平与蛋白水平并不完全一致,说明EPO的调控方式可能同时包括转录调控与翻译调控。

机体在非贫血状态下EPO水平含量极低,血中含量约10 m U/m L,但在低氧应激中可上升1 000倍,达到10 U/m L［19-20］。生理剂量下EPO是否与药理剂量下EPO具有相似功能还值得探讨。本研究结果发现,生理剂量下EPO(10 m U/m L)长期作用15天,Caco-2细胞内叶酸转运体PCFT、RFC的表达无显著变化。这一现象提示EPO在肠道细胞上的作用可能是机体在低氧胁迫下的应激反应,即通过促进造血原料的吸收、优化造血环境来刺激造血、改善低氧,而在正常情况下该作用处于静息状态。

综上所述,本研究采用体外培养Caco-2单层细胞,发现了EPO对叶酸肠道吸收的促进作用,以及高剂量EPO对叶酸转运的双向调控作用,对拓宽EPO作用机制的认识,深化了解肾性贫血患者体内病理生理的改变具有一定帮助。

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Effects of erythropoietin（Ep O）on the transport of folic acid across Caco-2 monolayers

YAN Jun-kai1,JIN Gui-ying1,RI Ho-nam2,YANG Qing1△
(1Department of Biochemistry,School of Life Sciences,Fudan University,Shanghai 200433,China；
2Department of Biochemistry,Faculty of Life Science,Kim Il Sung University,Pyongyang,D.P.R.Korea)

Objective To investigate the effect of erythropoietin(EPO)on the transport of folic acid across human colon adenocarcinoma cell line Caco-2 monolayers.MethodsTransport assays of folic acid in uptake direction and efflux direction were performed in Caco-2 monolayers with or without the supplement of EPO(0.3,1 and 3 U/m L).The effects of EPO on the expressions of folate transportersproton coupled folate transporter(PCFT),reduced folate carrier(RFC)and multidrug resistanceassociated protein 2(MRP2)were analyzed by real time-PCR and Western blot.ResultsTransporter-mediated uptake of folic acid was enhanced by EPO treatment in a dose-dependent manner,and the increasing degrees were 31.6%,61.5%and 120.5%for 0.3,1 and 3 U/m L EPO,respectively.The efflux of folic acid was enhanced only by EPO at high dose(3 U/m L),and the increasing degree was 56.9%.The expression levels of folate transporters(PCFT,RFC and MRP2) were up-regulated by EPO in a dose-and time-dependent manner.ConclusionsEPO at high does bidirectionally regulates the transport of folic acid.The uptake of folic acid was enhanced by EPO in a dose-dependent manner while the efflux of folic acid was enhanced by EPO of high dose.

folic acid； erythropoietin(EPO)； Caco-2 cell； folate transporter

Q 563+.8；Q 735

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2014.01.005

2013-03-07；编辑：王蔚)

国家自然科学基金(30873153)

△Corresponding author E-mail：yangqing68@fudan.edu.cn

*This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(30873153).