不同比例聚乳酸-聚己内酯/泊洛沙姆静电纺纳米材料作为皮肤支架的可能性

刘宁华缪月娥亓发芝 顾建英△

(1复旦大学附属中山医院整形外科 上海 200032；2复旦大学高分子科学系聚合物分子工程国家重点实验室 上海 200433)

不同比例聚乳酸-聚己内酯/泊洛沙姆静电纺纳米材料作为皮肤支架的可能性

刘宁华1缪月娥2亓发芝 顾建英1△

(1复旦大学附属中山医院整形外科 上海 200032；2复旦大学高分子科学系聚合物分子工程国家重点实验室 上海 200433)

目的探讨不同比例聚乳酸-聚己内酯/泊洛沙姆［poly(ε-caprolactone-co-lactide)/Poloxamer,PLCL/ Poloxamer］静电纺材料作为皮肤组织支架的可能性。方法静电纺丝技术制备纯PLCL及PLCL/Poloxamer比例75/25、85/15、90/10、95/5的纳米纤维材料,测定支架表面形态、机械以及亲水性能。将脂肪干细胞接种至支架表面,第1、3、7、10天行水溶性四唑盐(CCK-8)分析,并于第3天扫描电镜观察细胞形态。结果90/10、95/ 5比例支架的断裂强度高于纯PLCL及75/25、85/15比例支架(分别为9.31±0.29,9.27±0.50,7.08±0.21, 7.46±0.27和7.47±0.21,MPa),90/10、85/15、75/25比例的水接触角低于纯PLCL及95/5比例(分别为0°, 0°,0°,131.5°±8.9°和7.8°±2.7°)。在第1、3、7、10天时,PLCL/Poloxamer材料脂肪干细胞黏附及增殖能力明显高于纯PLCL。扫描电镜显示90/10比例PLCL/Poloxamer支架上有大量脂肪干细胞生长,细胞形态完整、表面光滑。结论90/10比例PLCL/Poloxamer支架的机械性能及亲水性能高于其他组,该材料与大鼠脂肪干细胞的相容性良好,是更适合脂肪干细胞黏附及增殖的组织工程材料。

脂肪干细胞； 静电纺丝； 皮肤； 聚乳酸-聚己内酯/泊洛沙姆； 扫描电镜

对于严重烧伤或机械伤致大面积的皮肤组织缺损,目前临床上常采用自体皮瓣或皮片移植来进行修复,但是由于自体皮瓣或皮片的组织量有限,尚无法满足临床的应用。因此,临床上常采用人工组织工程皮肤来修复。采用静电纺丝技术构建的组织工程支架厚度可在0.05～2 mm之间,与皮肤表皮层及真皮层的厚度一致,这使得静电纺的材料在几何尺寸上与细胞外基质的微观结构存在一致性［1-2］。聚乳酸-聚己内酯［poly(ε-caprolactone-co-lactide, PLCL)］是一种人工合成的高分子聚合材料,它取材广泛、容易降解,同时具有良好的柔韧性、抗磨损性和一定的机械强度,近年来被较广泛地应用于组织工程的支架［3-4］。但PLCL亲水性不够,寻找一

种材料与之共纺成为必要。泊洛沙姆(Polomaxer)是聚氧乙烯共聚物,是一类新型的高分子离子表面活性剂,常用作药物辅剂,其毒性小、无色,具有两端亲水、中间疏水的特性［5-6］。我们采用静电纺丝技术制备纯PLCL及比例为75/25、85/15、90/10、95/ 5的PLCL/Poloxamer纳米纤维材料,检测支架表面形态、机械性能以及亲水性等特性,并将脂肪干细胞(adipose-derived stem cell,ADSCs)接种在不同配比的静电纺纳米支架上,体外观测其生物组织相容性,筛选一种最佳配比的PLCL/Polomaxer纳米材料,以期作为修复皮肤创面的组织工程材料。

材料和方法

仪器试剂PLCL(聚乳酸-聚己内酯,山东济南岱罡生物科技有限公司公司,其聚乳酸与聚己内酯比值为7∶3)。Polomaxer(泊洛沙姆,复旦大学材料学院提供)。静电纺丝设备(Onizuka Glass公司,日本),搅拌器(BT124 S,北京赛多利斯),拉力测试仪(CMT8501型,深圳新三思集团),水接触角测试仪(OCA40,Dataphysics,德国),扫描电子显微镜(JSM-5600LV,日本),酶标仪(RT-6000,美国),正置、倒置相差显微镜(Olympus公司,日本)。磷酸盐缓冲液(PBS)、青链霉素双抗和0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA(1∶1)(中国吉诺生物有限公司)。低糖DMEM培养基、胎牛血清(FBS)(Gibco公司)。CCK-8(日本同仁化学研究所)。六氟异丙醇、Ⅰ型胶原酶、二甲基亚砜(DMSO)(美国Sigma公司)。

脂肪干细胞原代培养脂肪干细胞来自复旦大学上海医学院动物实验中心提供的SD大鼠,按照Yoshimura等［7］介绍的方法,常规备皮、消毒、铺巾,用20号刀片平行于腹股沟方向切开皮肤,眼科剪将腹股沟脂肪分离并取出,置于无菌生理盐水中,并尽快分离细胞。在显微镜下将脂肪组织内的小血管挑取出来,置于玻璃板上,用眼科剪反复裁剪成1 mm3大小的碎片。移入消化瓶后加入4倍体积的0.1%I型胶原酶,摇匀密封后置入37°的恒温摇床中消化1 h。消化结束后,用200目滤网过滤未消化组织碎片,将滤液移入15 m L离心管中400×g离心5 min,弃上清液,加入7～8 m L PBS吹匀细胞后400 ×g再次离心5 min,弃上清液后吸取低糖DMEM 4～5 m L(10%胎牛血清,青霉素和链霉素含量100U/m L)滴入离心管吹打细胞,将细胞移入25 cm2培养瓶中并置于37℃,5%CO2培养箱内孵育过夜。2天换一次液,原代培养第6天时细胞达到80%融合,用0.25%胰酶-0.02%EDTA(1∶1)消化传代。第3代为目的细胞,即脂肪干细胞。

pLCL/polomaxer静电纺丝纳米材料制备将各比例的PLCL、Polomaxer溶解在六氟异丙醇溶剂中,在磁力搅拌器下溶解4～6 h成稳定均一透明的溶液,静置30 min后备用。共混静电纺丝实验在室温下进行,将纺丝液吸入1支1.0 m L或2.5 m L的注射器,注射器金属针头内径为0.42～0.58 mm,通过包有绝缘皮的电线和铁头将静电高压发生器(可以提供0～50 k V的直流电压)和针头连接起来,将一片钻箔用双面胶粘到硬纸板上,然后放置到针头正下方12～15 cm处,作为接地的接收器,用于接收静电纺纤维。在高电压作用下,纺丝液在电场中喷射形成纤维沉积在接收器上,形成纤维膜。

支架扫描电镜检测将收集在铝箔上的静电纺纤维试样镀金90 s,然后在10 k V加速电压下,用扫描电子显微镜(scanning electron microscopy, SEM)观察静电纺纤维的形态并拍照。为了统计不同样品的纳米直径分布范围,将所得的SEM图像用图像分析软件Image J对制备的纳米纤维进行直径测量。

支架力学性能测定将电纺所得的厚度一定(100μm)、不同比例的PLCL/Polomaxer电纺膜裁成5 mm×50 mm的长条形样条,在拉伸仪上于室温下进行单轴拉伸试验,微调机头位置待电纺材料略微张紧后开始拉伸测试。拉伸速度为20 mm/ min。重复检测5个样本。

支架水接触角测定采用100μm平整的不同比例的PLCL/Polomaxer材料,测试时水滴体积为3μL,测试环境为室温。通过光学显微镜的摄像头观察水滴在片材表面的变化情况,接触角由图象分析软件自动测定。选用的测定频率为2 Hz,得到样品的水接触角情况。重复检测5个样本。

静电纺丝支架的细胞种植将支架材料均剪成直径为7 mm的圆形支架,紫外灯照射1 h后,浸泡于75%酒精中消毒12 h,取出后用PBS反复冲洗3次,每次5 min,晾干备用。将圆形支架置于96孔板内,铺平于孔板底,加入50μL低糖DMEM预湿12 h。调节细胞浓度为5×104/m L,吸取20μL细胞悬液加在材料表面,并充分摇匀,使得细胞悬液能接触到材料的所有表面,同时空白孔加入细胞悬液20μL作为对照,然后将孔板置于37℃,5%CO2培养箱内孵育,4 h后加入低糖DMEM(10%FBS, 100 U/m L青霉素和链霉素)80μL继续培养,隔天更换培养液。

CCK-8检测从加入细胞悬液开始计时,分别在细胞培养的第1、3、7和10天加入10μL CCK-8反应液,置于37℃,5%CO2培养箱内孵育4 h,震荡混匀后从各孔内吸取出混合液体100μL转入另外的96孔板内,用酶联免疫检测仪测量450 nm处吸光度(D)值,第1天和第3天数值反应细胞与支架的黏附情况,第7天和第10天数值反应细胞在支架上的增殖情况。每个样品设置3个复孔。实验重复3次。

ADSCs与pLCL/polomaxer体外培养扫描电镜观察脂肪干细胞与纯PLCL、85/15、90/10、95/5 PLCL/Polomaxer材料培养3天后取出,采用锇酸固定,丙酮梯度脱水的方法处理样品,预冷临界点干燥仪将样品干燥后,用导电胶将样品固定在电镜台上。喷金后(10 m A,90 s)在真空扫描电镜上进行细胞的形态观察。

统计学分析各项定量指标均以x—±s的形式表示,应用SPSS 16.0软件包对各定量指标进行统计学分析,不同材料组之间的各观察值用单因素方差分析(ANOVA),比较不同时间点不同组间的各观察值采用单个重复测量因素方差分析(analysis of variance of repeated measures data),多重比较采用最小显著差值法(Least-significant difference, LSD)。当P＜0.05认为差异有统计学意义。

结 果

不同配比pLCL与polomaxer扫描电镜及纤维直径检测扫描电镜结果见图1 A-E,可见所得静电纺丝材料纤维表面光滑。除PLCL/Polomaxer比例75/25支架出现纤维融合外,其余各组纤维形态清晰,且直径的变异系数变化不大。通过Image J软件测量支架纤维直径,75/25 PLCL/Polomaxer纤维直径为(2.74±1.22)μm,明显大于PLCL、85/ 15、90/10和95/5组支架［分别为(1.58±0.47) μm、(1.60±0.65)μm、(1.55±0.39)μm和(1.61 ±0.52)μm,P＜0.05］,差异具有统计学意义；其余各组的纤维直径差异无明显统计学意义。

不同配比pLCL与polomaxer力学性能测量结果力学性能检测结果提示不同配比PLCL与Polomaxer的力学测量提示各组分之间的拉伸模量差异并无统计学意义,且均在正常皮肤范围以内。90/10、95/5的PLCL/Polomaxer的拉伸强度均大于单纯PLCL、75/25、85/15等组,差异存在显著性,但这两组之间差异无统计学意义,各组分的拉伸强度均在正常皮肤范围以内。90/10、95/5的PLCL/ Polomaxer的断裂伸长率两者差异无统计学意义,但均大于PLCL组,小于75/25、85/15等组,各组的断裂伸长率均高于正常皮肤范围(表2)。

不同配比pLCL与polomaxer水接触角测量结果水接触角测量结果提示纯PLCL材料的接触角为131.5°±8.9°；75/25、85/15及90/10的水接触角为0°；95/5水接触角为7.8°±2.7°(图2)。

CCK-8检测ADSCs在PLCL/Polomaxer各组支架上培养后第1天,Control、PLCL、75/25、85/ 15、90/10、95/5等组的D值分别为0.20±0.06、0.19±0.04、0.35±0.11、0.33±0.05、0.35±0.16、0.31±0.09。培养后第3天,D值分别为0.44± 0.08、0.36±0.10、0.67±0.16、0.64±0.09、0.69± 0.07、0.59±0.16。培养后第7天,D值分别为1.13 ±0.14、0.78±0.21、1.47±0.11、1.51±0.21、1.54 ±0.23、1.49±0.17。培养后第10天,D值分别为1.47±0.09、1.23±0.16、1.73±0.10、1.79±0.35、1.72±0.33、1.80±0.18(图3)。

采用重复测量的方差分析进行检验,发现培养不同时间时,不同方法间的结果存在差别(F=18.308, P＜0.01)。通过LSD两两比较,Control组与PLCL组和75/25、85/15、90/10、95/5等组的D值之间存在差异,P值分别为0.019,0.01,0.01,0.01,0.02；

(1)vs.PLCL and control group；(2)vs.PLCL group,P＜0.05.Cell number of ADSCs on 75/25,85/15,90/10 and 95/5 PLCL/Polomaxer is greater than PLCL and control group at day 1, 3,7 and 10；Cell number of ADSCs on control group is greater than PLCL group at day 3,7and 10. PLCL组与75/25、85/15、90/10、95/5等组的D值之间存在差异,P值均＜0.01；75/25、85/15、90/10、95/ 5等组的D值之间的差异不具有统计学意义,P值均＞0.05。

ADSCs在pLCL/polomaxer材料上的扫描电镜观察结果ADSCs在纯PLCL、85/15、90/10、95/5 PLCL/Polomaxer纳米材料上培养第3天时,将细胞与支架的共培养物取出行扫描电镜观察(图4),结果显示纯PLCL上面的干细胞形态聚缩,并未完全展开,表示纯PLCL与细胞的亲和力不佳。PLCL/ Poloxamer 85/15、90/10、95/5比例材料上的细胞形态学并无明显区别,细胞形态呈长梭形或多边形,表面光滑,形态完整,伸出较多足突与材料黏附紧密,细胞之间也已经通过伪足联系起来。

讨 论

近年组织工程技术的进步、组织工程皮肤的不断完善,为大面积皮肤缺损和慢性创面修复提供了新的途径,探索一种接近正常皮肤物理和生理特性的人工皮肤成为必要。PLCL是聚乳酸-聚己内酯混合制成的有机高分子材料,大多数研究者认为比值7∶3是较好的机械性能［8-9］。本实验结果显示PLCL的接触角为131.5°±8.9°,亲水性较差,故水等电解质不易

透过。Polomaxer是聚氧丙烯与聚氧乙烯的共聚物,是一类新型的高分子离子表面活性剂,目前常用作药

物的乳化剂、稳定剂、增溶剂和吸收促进剂等［10-11］,且来源广泛、价格低廉、容易获取,因此本实验拟采用高分子的Polomaxer与PLCL共纺纳米支架。本实验结果提示PLCL/Polomaxer比例75/25支架出现较严重的纤维融合,因此75/25不宜作为本实验的组织工程支架材料。进一步选取PLCL/Polomaxer比例95/5、90/10、85/15作为皮肤组织工程的支架材料。

理想的人工皮肤要求具有良好的生物组织相容性和表面活性,并且需要一定的可塑性、机械拉伸强度及抗磨损特性［12-13］。本实验发现PLCL与Polomaxer共纺的纳米材料纤维表面光滑,85/15、90/ 10及95/5比例的共纺支架纤维直径分布均匀,且并未出现纤维融合的情况。材料的力学性能测定显示静电纺纳米材料均具有较好的拉伸模量和拉伸强度,其中90/10及95/5比例的共纺支架拉伸强度最好,不易断裂,与正常皮肤最为接近。水接触角的测定提示Polomaxer的加入可明显改善PLCL的亲水性能,其中75/25、85/15、90/10比例共纺后水接触角均为0°,而95/5的水接触角为7.8°±2.7°,提示其亲水性比其他3种稍差。CCK-8结果提示75/25、85/15、90/ 10及95/5比例的共纺支架上ADSCs的黏附增殖性能均明显高于纯PLCL组,但各比例共纺支架之间差异并无统计学意义。综上因素,90/10比例PLCL与Polomaxer共纺静电纺纳米材料可能更与皮肤的特性接近。该支架与ADSCs共培养3天后的扫描电镜发现ADSCs形态完整、表面光滑、伸出较多足突与材料黏附紧密,而细胞形态学表现是反映细胞亲和力的直接证据［14］。提示90∶10 PLCL/Polomaxer共纺静电纺纳米材料可以用作组织工程支架覆盖创面,能促使种子细胞吸附,细胞因子和组织液容易透过支架,营养种子细胞,从而可以促进创面愈合。

组织工程皮肤的目标是应用于临床,促进创面愈合的同时发挥屏障防护作用是其目标。严重烧伤、机械伤所致大面积皮肤组织缺损一直是创面愈合研究领域的热点难点,新型的组织工程皮肤有望实现大面积创面治疗领域的新突破。本实验研讨不同比例PLCL/Polomaxer静电纺纳米材料作为组织工程皮肤的可行性研究,是新型的组织工程材料PLCL/ Polomaxer复合脂肪干细胞修复大面积皮肤创面研究的重要组成部分,两者相容性的确立可为下一步的成表皮诱导及动物实验提供实验基础。

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The possibility of different proportions of electrospun nanomaterials p LCL/poloxamer as a skin tissue substitute

LIU Ning-hua1,MIAO Yue-e2,QI Fa-zhi1,GU Jian-ying1△
(1Department of Cosmetic and Reconstructive Surgery,Zhongshan Hospital,Fudan University,Shanghai 200032,China；
2State Key Laboratory of Molecular Engineering of Polymers-Department of Macromolecular Science, Fudan University,Shanghai 200433,China)

Objective To investigate the possibilities of different proportion of poly(ε-caprolactoneco-lactide)/Poloxamer(PLCL/Poloxamer)scaffolds work as a skin tissue engineering substitute.MethodsElectrospinning pure PLCL and PLCL/Poloxamer ratio of 75/25,85/15,90/10,95/5 nanofibers were prepared,and their surface morphology,mechanical and hydrophilic properties were measured.The adipose stem cells(ADSCs)were seeded on the scaffolds surface,and the scaffolds biologically activities with ADSCs were determined through water-soluble tetrazolium salt test(CCK-8)on day 1,3,7,10.Scanning electron microscopy was applied to observe the ADSCs morphology on day 3.ResultsThe nanofiber scaffoldsˊbreaking strength of 90/10 and 95/5 ratio was higher thanpure PLCL and 75/25,85/15 ratio(9.31±0.29,9.27±0.50,7.08±0.21,7.46±0.27,and 7.47± 0.21 MPa,respectively),and the water contact angle of 90/10,75/25,85/15 ratio was less than pure PLCL and 95/5 ratio(0°,0°,0°,131.5°±8.9°,and 7.8°±2.7°,respectively).On day 1,3,7,10,the adhesion and proliferation of ADSCs on PLCL/Poloxamer material was significantly higher than pure PLCL.Scanning electron microscopy showed that the 90/10 PLCL/Poloxamer scaffolds had a lot of ADSCs,the cells had complete cell morphology and smooth surface.Conclusions90/10 ratio of PLCL/Polomaxer had better mechanical properties and hydrophilicity than other groups,and the compatibility with ADSCs was better than pure PLCL.Therefore,90/10 ratio of PLCL/Polomaxer is more suitable tissue engineering material for skin tissue engineering.

adipose-derived stem cells； electrospinning； skin； PLCL/Poloxamer； scanning electron microscopy

R 628

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2014.01.006

2013-07-08；编辑：沈玲)

国家重点基础研究发展计划(973计划,2009CB930000)

△Corresponding author E-mail：gu.jianying@zs-hospital.sh.cn

*This work was supported by the National Key Basic Research program of China(2009CB930000)