丙酮酸激酶M2型（p KM2）入核机制和核内作用的研究进展

詹 成(综述） 时 雨 马 军 王 琳 王 群(审校）

(复旦大学附属中山医院胸外科 上海 200032)

丙酮酸激酶M2型（p KM2）入核机制和核内作用的研究进展

詹 成(综述） 时 雨 马 军 王 琳 王 群△(审校）

(复旦大学附属中山医院胸外科 上海 200032)

传统观点认为丙酮酸激酶M2型(pyruvate kinase M2,PKM 2)通过催化肿瘤细胞糖代谢来促进肿瘤细胞生长。近年来研究发现除了酶催化功能外,PKM2还能通过多种途径进入细胞核,在核内作为蛋白激酶广泛参与转录调控、蛋白修饰等过程。本文将就这方面的研究成果作一综述。

丙酮酸激酶M2型(PKM2)； 细胞核； 糖酵解

丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK)是细胞糖酵解途径的关键酶,其催化磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate,PEP)和ADP生成丙酮酸和ATP。人体内存在4种PK同工酶,分别为L、R、M1和M2型。其中M1型和M2型均由PKM基因编码,通过不同的外显子剪接方式形成,两者仅在第378位至第434位氨基酸间有23个氨基酸不同［1］。PKM2存在二聚体和四聚体两种分子构象,并能互相转化,其主要在胚胎细胞、成体干细胞中表达,并且随着胚胎分化逐渐被其他3种同工酶代替,但肿瘤细胞中PKM2表达重新升高并取代原表达的PK同工酶类型［2-3］。

肿瘤细胞即使在有氧条件下,也经由糖酵解转化大量葡萄糖生成乳酸,这一现象被称为Warburg效应,是肿瘤细胞能量代谢最基本的改变之一。研究表明,PKM2是导致这一效应的关键因子［4］。

传统观点认为,PKM2在细胞质中与其他糖酵解酶如己糖激酶、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)等一起构成糖酵解酶复合体［5-6］。这一空间上的邻近关系使它可以高效催化葡萄糖经由糖酵解生成乳酸和能量,而不是进入线粒体进行有氧呼吸［5,7-8］。大量糖酵解中间产物在细胞中积累,这些产物经由多种代谢途径用于核酸、脂类和蛋白质等生物大分子的合成,而这些原料为快速生长增殖的肿瘤细胞所必需［5,9-10］。

近年来研究发现,原本定位在细胞质中的PKM2除了在能量代谢中发挥酶催化作用外,还可以通过多种途径进入细胞核,进而广泛参与转录调控、蛋白修饰等过程。

pKM2进入细胞核的机制早在1988年Gumińska等［11］就报道了在小鼠Ehrlich腹水瘤细胞和大鼠Morris肝癌细胞核提取物中发现有PKM2存在,但限于当时研究背景和条件并未对其进入细胞核的途径进行研究。2007年Hoshino等［12］用双杂交技术寻找小鼠原B细胞系BB13在IL-3刺激下进入细胞核的蛋白质,分别构建了含Lex A-Gal4-目标蛋白c DNA和Lex Ar结合序列-GFP的质粒并转染BB13细胞。结果发现当转染质粒中含PKM2序列时,IL-3刺激导致细胞核内荧光显著增强,这说明IL-3刺激使PKM2转入细胞核,随后他们通过对细胞核蛋白的Western blot实验验证了这一点。通过构建含不同PKM2 cDNA片段的质粒,Hoshino等［12］进一步证明PKM2 C结构域的139个氨基酸残基是导致PKM2进入细胞核能力的关键部分,但这部分结构并不象传统核定位序列(Nuclear localization signal,NLS)那样富含精氨酸和赖氨酸。Hoshino等［12］通过用非受体型酪氨酸蛋白激酶2(Janus Kinase 2,JAK 2)抑制剂AG-490处理细胞,观察到IL-3诱导的PKM2核转位几乎完全被阻滞,这说明JAK 2在IL-3刺激诱导PKM2进入细胞核的过程中起着关键作用,但进一步的作用机制仍不明确。

Stetak等［13］在研究生长抑素诱导细胞凋亡的机制时,采用碘125标记的生长抑素类似物TT-232、蛋白质交联剂BS3［Bis(sulfosuccinimidyl) suberate］与皮肤基底癌细胞A431提取物共同孵育,进而通过高效液相色谱-质谱技术鉴定与TT-232相互作用的蛋白质,发现TT-232能与PKM2相结合。Stetak等［13］进一步在非洲绿猴肾细胞系Cos-7中验证TT-232及生长抑素能否特异性地与PKM2作用,并通过荧光素报告基因、免疫荧光和Western Blot技术检验PKM2在细胞内的分布,证实生长抑素及其类似物刺激细胞致使PKM2进入细胞核,随后他们利用相似的技术发现H2O2、紫外线同样能促使PKM2进入细胞核。

Spoden［14］等通过酵母双杂交技术研究与PKM2相互作用的蛋白质,发现PIAS3(protein inhibitor of activated STAT3)通过羧基端383-619位氨基酸构成的底物结合结构域与PKM2相结合。而已知PIAS3主要是作为SUMO(small ubiquitinrelated modifier)E3连接酶起作用,参与SUMO化修饰,抑制干扰素调节因子调控蛋白1(interferon regulatory factor 1)和MITT(microphthalmiaassociated transcription factor)的转录活性［14-16］。在骨肉瘤细胞系U-2中进行的免疫共沉淀实验进一步证实了PKM2能与PIAS3形成复合物［14］。Spoden等［14］处理U-2细胞以维持蛋白质的SUMO化状态,随后对细胞裂解液行免疫共沉淀实验,检测到在除正常PKM2条带外的另一条带；在未经维持SUMO化处理的普通Western blot实验中,该条带亮度大为减弱,这说明一部分PKM2确实被SUMO化修饰,但该修饰不稳定,处在不断变化之中。上调PIAS3表达时发现SUMO化的PKM2含量只有轻微升高,这说明除了PIAS3外还有其他修饰蛋白在PKM2的SUMO化中起作用［14］。在高表达PIAS3的U-2和小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3中,利用免疫荧光双染技术能观察到PIAS3主要分布于细胞核中,PKM2在细胞核和细胞质中都有分布,而在普通的U-2细胞核中未观察到PKM2存在［14］。过表达Ring结构域突变而无催化活性的PIAS3并不能促使PKM2进入细胞核,这说明该结构域在这一过程中起着重要作用［14］。

Yang等［17-18］利用免疫荧光方法发现,在人脑胶质瘤细胞U87/EGFR、U251中,表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)刺激致使PKM2在细胞核中积聚,并在人前列腺癌细胞DU145、人乳腺癌细胞MDA-MB-231中验证了这一点。Yang等［17］分别用EGFR、磷酸肌醇3激酶、Src、JNK、MEK(MAP-kinase kinase)/ERK(extracellular regulated protein kinases)抑制剂处理细胞以阻断EGFR、蛋白激酶B(protein kinase B,AKT/PKB)、c-Src,c-Jun和ERK 1/2的磷酸化,观察对EGF刺激所致的PKM2核转位的影响,证实EFGR及下游ERK 1/2的激活对PKM2进入细胞核起关键作用。Yang等［17］还证实了ERK2通过其富含酸性氨基酸的结构域和谷氨酸天冬氨酸口袋组成的对接槽(docking groove)与PKM2第429位异亮氨酸和第431位亮氨酸组成的结构相特异性结合,两者结合促进ERK 2对PKM2第37位的丝氨酸磷酸化；随后,多肽脯氨酰基顺反异构酶PIN 1［protein interacting with NIMA(never in mitosis A)-1］结合PKM2第37位磷酸化的丝氨酸和第38位的脯氨酸,催化PKM2该部分的顺反异构,PIN1调控输入蛋白importinα5与PKM2第399位和400位的精氨酸相结合,并最终运输PKM2进入细胞核［17］。

pKM2在细胞核内的作用Ignacak等［19］采用亲和层析提取大鼠Morris肝癌细胞核PKM2,并测定饱和底物情况下PKM2的活性,研究发现组蛋白H1和赖氨酸能明显降低PKM2催化PEP生成丙酮酸的速率,组蛋白H1或赖氨酸能接受PEP所携带的高能磷酸基团,而精氨酸或组氨酸不具备这一能力。结合既往研究结果,Ignacak等［19］认为PKM2能发挥蛋白激酶的作用,把PEP上的磷酸基团转移到组蛋白H1上富含赖氨酸的ε氨基上,通过组蛋白H1的磷酸化在DNA的复制和转录中发挥重要作用。

Hoshino等［12］在BB13细胞系通过转染含NLS-PKM2 cDNA质粒来促进PKM2进入细胞核中,结果发现单独转染对BB13细胞的生长无显著影响,但当在培养液中加入EGF时,细胞核中的PKM2增加显著促进细胞生长,这说明核内的PKM2能与EGF协同发挥促细胞增殖的作用［12］。

Stetak等［13］利用表面等离子共振(surface plasmon resonance technology)等技术发现生长抑素及其类似物对PKM2的作用并不会影响PKM2的酶活性,同样使用转染含NLS-PKM2基因质粒的方法促进PKM2进入Cos-7细胞核,观察到细胞凋亡,与生长抑素的作用类似,而转染PKM2同工酶PKM1的对照组未发生细胞凋亡。这一实验过程中未观察到caspase-3激活,采用广谱caspase抑制剂处理细胞也不能抑制细胞凋亡,这说明核PKM2并非通过经典的caspase途径促进细胞凋亡［13］。Stetak等［13］将突变后丧失酶活性的PKM2 (第294位的赖氨酸突变为蛋氨酸)转入细胞核,同样能观察到其促进凋亡的作用,这一实验结果进一步证明了核内PKM2的作用不依赖于酶活性。

Lee等［20］利用GST株层析和质谱技术研究小鼠畸胎瘤细胞P19中与八聚转录因子4(octamerbinding transcription factor 4,Oct-4)POU DNA结合结构域相互作用的蛋白质时,发现并通过免疫共沉淀技术在人肾上皮细胞293T中进一步验证了PKM2与Oct-4的特异性结合,随后通过对纯化的PKM2和Oct-4进行细胞外共同孵育及Western blot检测,证明两者直接结合而不需其他蛋白介导。对PKM2与Oct-4不同片段的研究证实,PKM2包含C结构域的307～531位氨基酸和Oct-4的POU结构域是两者结合的关键部位［20］。Lee等［20］通过质粒转染上调PKM2和Oct-4在COS-7细胞和293T细胞中的表达,并通过免疫荧光双染技术观察到小部分PKM2和全部Oct-4定位在细胞核中,两者在细胞核内存在互相作用的可能；随后在Oct-4表达上调的COS-7细胞和HeLa细胞中,通过比较上调PKM2表达与对照组含Oct-4结合位点与荧光报告基因质粒的表达情况,发现PKM2使Oct-4的转录活性增加了2.5倍。

Luo等［21-22］通过同位素标记和定量质谱的方法发现PKM2与HIF-1α相互结合,对缺氧培养的He La细胞核提取物行免疫共沉淀实验,证实核PKM2与HIF-1α特异性结合。GST柱层析实验证实PKM2能结合HIF-1α多个不同的结构域,其中包含575～786位的负调节HIF-1α转录活性的结构域［21-22］。Luo等［21-22］在He La细胞核肝癌细胞Hep3B中转染融合了缺氧反应元件(hypoxia response element,HRE)和荧光报告基因的质粒,随后通过病毒转染上调PKM2表达,发现荧光显著增强,而敲除PKM2则明显降低HIF-1的转录活性,这两个过程中并不伴随HIF-1α或HIF-1β表达的变化,这说明核PKM2通过增强HIF-1的活性发挥作用。PKM2能结合HIF-1α转录活性结构域并促进HIF-2活性,这一功能与PKM2的酶活性无关,而PKM1没有促进HIF活性的作用［21-22］。进一步研究证实,脯氨酸羟化酶3(prolyl hydroxylase 3,PHD3)羟化PKM2第405位和第408位的脯氨酸,促进PKM2与HIF-1α的结合,进而促进HIF-1α与HRE的结合,并且PKM2募集组蛋白乙酰化酶p300乙酰化组蛋白第9位的酪氨酸,最终促进下游基因如LDH-A、丙酮酸脱氢酶激酶1、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)等的转录［21-22］。Luo等［21-22］还发现PKM基因第一内含子反义链上包含HRE元件,并证明HIF显著促进PKM2表达,这样就形成了一个循环促进的机制。

Gao等［23］在过表达PKM2的人结肠癌细胞SW620中采用芯片技术分析其他基因表达的变化,发现MEK 5表达较对照组升高了6倍,在SW620和SW480细胞中敲除PKM2可以导致MEK 5表达显著降低。在多个细胞系中的研究发现,核PKM2、MEK 5与细胞增殖速度相关,敲除MEK 5可以抑制PKM2上调对细胞增殖的促进作用,但不抑制PKM2的表达,这说明MEK5在核PKM2促进细胞增殖过程中起着重要作用［23］。进一步研究证明,核PKM2在生理条件下能以PEP而不是ATP为底物,通过磷酸化信号转导与转录活化因子3(signal transducers and activators of transcription 3,Stat 3)第705位上的酪氨酸,促进Stat3与MEK 5启动区域结合,进而促进MEK5的转录,这一磷酸化过程中不伴随常见的磷酸化Stat3的蛋白激酶JAK 2和c-Src表达的变化［23］。Gao等［23］通过凝胶过滤层析技术发现核PKM2主要以二聚体形式存在,通过构建第399位的精氨酸突变为谷氨酸的PKM2,干扰PKM2各亚基间的连接以维持二聚体状态的PKM2。与正常的PKM2及PKM1比较发现,二聚体PKM2能更有效地磷酸化Stat3,说明主要是二聚体PKM2发挥蛋白激酶的作用,而PKM1没有磷酸化Stat3的作用。Stat3可竞争性结合突变型PKM2的ADP结合位点,而过表达突变型PKM2能显著上调细胞核内的PKM2含量、Stat3磷酸化、MEK 5表达和细胞增殖［23］。

Yang等［18］在U87/EGFR细胞中采用sh RNA敲除PKM2,极大降低了细胞在基础状态和在EGF刺激下的增殖速度,并且显著阻断了EGF对周期素D1(Cyclin D1)和c-Myc表达的促进作用,而周期素D1和c-Myc是β-catenin重要的下游因子。Yang等［18］采用荧光素报告基因、免疫共沉淀和染色质免疫共沉淀技术证明,敲除PKM2可抑制EGF诱导的β-catenin激活,阻碍β-catenin与周期素D1编码基因CCN D1(coding for cyclin D1)与c-Myc启动子区域相结合,并抑制β-catenin与转录因子TCF4相结合；敲除PKM2不能阻断Wnt 1或Wnt 3A对β-catenin转录活性的促进作用,说明核PKM2在EGF诱导的β-catenin激活中发挥重要作用,但这一作用并非经Wnt通路实现。随后,Yang等［18］通过多种技术证实在EGF刺激下,EGFR下游因子c-Src转入细胞核,磷酸化β-catenin第333位的酪氨酸,进而促进细胞核内PKM2与β-catenin相结合,两者的结合及复合体与CCN D1启动子区域的结合并不依赖于PKM2的酶活性。核PKM2结合在CCN D1启动子区域,直接从PEP转移磷酸基团磷酸化附近组蛋白H3第11位的苏氨酸,这一作用需要PKM2的酶活性［24］。组蛋白H3在该位置的磷酸化修饰促使其与组蛋白脱乙酰化酶3(histone deacetylase,HDA C3)分离,从而促进组蛋白H3第9位的酪氨酸乙酰化,进而促进周期素D的转录［24］。核PKM2促进β-catenin与c-Myc启动区域相结合,进而促进c-Myc下游基因如葡萄糖转运体1(glucose transporter 1,GLU T1)、LDH-A等的表达,甚至通过多聚嘧啶序列结合蛋白(polypyrimidine tract binding protein,PTB)促进PKM2本身的选择性剪接［17］。另外,β-catenin下游因子DDK1(Dickkopf 1)也是核PKM2发挥作用的途径之一［18］。对人脑胶质瘤细胞、实验动物和临床病例标本的研究证实,核PKM2能促进细胞增殖、细胞从G1期转入S期、细胞Warburg效应、肿瘤形成并与临床分期及预后紧密相关［17-18,24］。

结语对于PKM2进入细胞核的机制及其在细胞核内的作用,近年来的研究已有较大进展。PKM2本身含有NLS序列,在多种因素作用下转入细胞核内。细胞核内的PKM2主要发挥蛋白激酶的作用,修饰多种重要的转录因子,调节它们的活性和下游基因的表达,在不同条件下发挥促进或抑制肿瘤细胞生长的作用。但在PKM2进入细胞核并发挥作用的过程中仍然有许多未知环节,有待进一步的研究明确。

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A review of the mechanism of pyruvate kinase M2ˊs nuclear translocation and its function in nucleus

ZHAN Cheng,SHI Yu,MA Jun,WANG Lin,WANG Qun△
(Department of Thoracic Surgery,Zhongshan Hospital,Fudan University,Shanghai,200032,China)

Conventional views states that the pyruvate kinase M2(PKM2)enhances the growth of cancer cells via catalying glucose metabolism.However,many recent studies have reaveled that PKM2 can be translocated into nucleus where it functions more vitally than catalying though a variety of ways.As a protein kinase,PKM2 widely participants in transciptional regulation and protein modification in the nucleus.These literatures will be briefly recapitulated in this review.

pyruvate kinase M2(PKM2)； nucleus； glucolysis

Q 493.4

B

10.3969/j.issn.1672-8467.2014.01.024

2012-12-28；编辑：王蔚)

高等学校博士学科点专项科研基金(20110071120066)；吴阶平医学基金(320.6750.12300)

△Corresponding author E-mail：wang.qun64@gmail.com

*This work was supported by Doctoral program Foundation of Institutions of Higher Education of China(20110071120066)and WU Jie-ping Medical Foundation(320.6750.12300).