大鼠蛛网膜下腔出血（SAH）后脑毛细血管的改变与迟发缺血性神经功能障碍（DIND）的关系

郭 晖李云鸿高 鹏赵 巍沈 冰

(1宁夏医科大学总医院神经外科 银川 750004；2宁夏医科大学研究生院,3医学科学技术研究中心 银川 750004)

大鼠蛛网膜下腔出血（SAH）后脑毛细血管的改变与迟发缺血性神经功能障碍（DIND）的关系

郭 晖1,2李云鸿2,3高 鹏2赵 巍2,3沈 冰1△

(1宁夏医科大学总医院神经外科 银川 750004；2宁夏医科大学研究生院,3医学科学技术研究中心 银川 750004)

目的利用激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope,LSCM)研究大鼠蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)后大脑毛细血管内径周长及周细胞形态变化,及其与迟发缺血性神经功能障碍(delayed ischemic neurological deficit,DIND)的关系。方法SD大鼠180只,随机分为SAH组(A组,n= 84)、生理盐水组(B组,n=84)和正常对照组(C组,n=12)。A组采用枕大池二次注血法建立SAH模型,B组同法注射等量生理盐水。A、B组分别在二次注血(或生理盐水)后1、3、5、7、9、11、13天取大脑,每组每时相取12个大脑。6个大脑用异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记的番茄凝集素进行大脑血管灌注染色后获取,其余6个进行周细胞结蛋白(Desmin)免疫荧光染色和HE染色。用LSCM测量毛细血管内径周长,并观察周细胞形态变化。HE染色用来观察脑组织病理形态。C组用以上同样方法观察。结果A组二次注血后3～11天脑组织出现局部缺血梗死的病理形态：组织结构紊乱、间质水肿、神经元变性坏死。B、C组大鼠大脑毛细血管内径正常,A组二次注血后第1天毛细血管内径无明显变化,第3天开始出现毛细血管管腔狭窄,第5天毛细血管内径周长变小达到高峰,高峰期持续至第7天,后逐渐缓解,第13天基本恢复正常。A组与B、C组相比,周细胞出现胞体聚缩的形态改变(P＜0.05)。结论SAH后大脑毛细血管管腔狭窄、周细胞形态异常可能与DIND的发生密切相关。

蛛网膜下腔出血(SAH)； 迟发缺血性神经功能障碍(DIND)； 毛细血管； 周细胞； 激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)； 大鼠

迟发缺血性神经功能障碍(delayed ischemic neurological deficit,DIND)是脑动脉瘤破裂后蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)最严重的并发症［1-2］,易导致SAH预后不良［3］。以往国内外研究认为迟发性脑血管痉挛(delayed cerebral vasospasm,DCV)或大血管结构的改变是DIND的主要原因,但随机、双盲对照的临床研究显示,DCV的逆转并没有改变患者的总体预后［2,4-5］,提示其发病机制需要进一步研究。毛细血管是构成脑微循环的主要血管,其中固细胞是主要收缩细胞,对微循环起重要的调控作用［6］。脑微循环改变可能是DIND的主要发病原因,而有关研究报道很少。对于周细胞和大脑毛细血管在SAN后的变化及其与DIND的关系,未见相关研究报告。

本实验拟建立大鼠枕大池二次注血SAH模型,利用激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope,LSCM)长程观察SAH后大脑毛细血管内径周长和周细胞形态变化,研究其变化和DIND发生之间的关系。这对明确DIND发病机制和今后进行针对性治疗和实验研究具有重要意义。

材料和方法

主要试剂及来源异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记的番茄凝集素(美国Vector公司)；兔抗大鼠结蛋白(Desmin)抗体、免疫荧光抗淬灭封片剂(北京博奥森公司)；罗丹明标记的山羊抗兔IgG(北京中杉金桥公司)；4ˊ, 6-二脒基-2-苯基吲哚(4ˊ,6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)显色液(江苏碧云天生物公司)。LSCM (FV1000 IX81,日本OLYMPUS公司)由宁夏医科大学提供。

实验动物及分组Sprague-Dawley大鼠180只,雌雄不拘,体质量270～320 g,随机分为3组：SAH组(A组,n=84),生理盐水对照组(B组,n= 84)和正常对照组(C组,n=12)。按二次注血(或注水)后第1、3、5、7、9、11及13天,A、B组又各分为7个亚组,每个亚组12只,6只用FITC标记的番茄凝集素进行大脑毛细血管灌注染色,其余6只进行脑组织Desmin免疫荧光染色和HE染色。C组各6只也采用以上方法观察。

SAH模型的制作用10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠,取枕下正中切口暴露环枕膜,A组抽取自体股动脉血0.3 m L,以0.1 m L/min的速度缓慢注入枕大池,注血后环枕膜穿刺处填塞明胶海绵一块,以小棉球压迫数分钟后缝合肌肉及皮肤,俯卧位头低30°约30 min,48 h后二次注血。B组同法注射等量生理盐水。术后侧卧位,保持体温在37℃左右,待翻正反射恢复后送回笼中,单独饲养。C组为正常大鼠。

标本获取A、B组分别在二次注血(或注水)后1、3、5、7、9、11、13天各处死12只大鼠。Desmin免疫荧光染色和HE染色标本采用灌注法处死获得,依次用37℃生理盐水300 m L及4%PBS 400 m L,从左心室快速灌注后取出带血管完整大脑,然后浸于4%中性多聚甲醛中继续固定24 h,脱水、透明、石蜡包埋。大脑毛细血管形态检测标本采用FITC标记的番茄凝集素0.5 mg从尾静脉快速注入,10 min后处死动物,取大脑快速冰冻［7］。

LSCM测量大脑毛细血管内径周长避光环境中,大脑横断面冰冻切片(8～10μm,每个标本切片4张),固定在防脱载玻片上,4%多聚甲醛固定组织15 min,PBS液(0.01 mmol/L)冲洗3遍,1.5μg/ m L DAPI溶液室温下滴染20 min,以PBS液(0.01 mmol/L)冲洗3遍,最后抗淬灭,封片剂封片。LSCM 400倍下单层扫描大脑毛细血管并进行DAPI(激发波长405 nm)及FITC(激发波长488 nm)双通道拍照并存储,用IPP 6.0专业图片分析测量系统进行图像分析,选取直径6～20μm毛细血管,测量其内径周长。

周细胞结蛋白（Desmin）免疫荧光染色及LSCM观察石蜡切片(每标本切片4张)烤片、脱蜡,抗原修复(高压煮沸法),0.01 mol/L的PBS冲洗3次,山羊血清封闭,滴加兔抗大鼠Desmin IgG,孵育后PBS冲洗,避光滴加罗丹明标记的山羊抗兔IgG, PBS冲洗,DAPI染核,封片。LSCM 400倍下单层扫描大脑毛细血管周细胞并进行DAPI(激发波长405 nm)及罗丹明(激发波长543 nm)双通道拍照并存储。观察周细胞形态变化。

HE染色及脑组织切片病理形态观察石蜡切片脱蜡至水,氧化苏木精染液染细胞核,1%伊红浸染,脱水至透明,中性树胶封固。Olympus BH2-RFCA显微镜下(×400)对切片进行脑组织病理形态观察并拍照。

统计学处理采用SPSS 17.0软件包作统计学处理,数据资料以x—±s表示。同组不同时间点数据间比较采用单因素方差分析,不同组同时间点两两比较采用两组独立样本资料的t检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

动物术后情况B、C组大鼠无死亡。A组大鼠二次注血后1天无死亡,3天死亡1只,5天死亡3只,7天死亡2只,9天死亡1只,11天死亡1只,13天无死亡。A组存活大鼠术后反应迟钝、自洁性差、毛发杂乱、主动攻击行为消失、饮水摄食活动减少。

LSCM下大脑毛细血管内径周长的时相变化

大脑毛细血管管壁细胞膜染为绿色荧光(FITC),胞核染为蓝色荧光(DAPI)。B组与C组不同时相毛细血管管径正常。A组大鼠二次注血后第1天时毛细血管内径周长无明显变化,3天时毛细血管内径周长明显变小,至第5天达到高峰,高峰期持续至第

7天,后逐渐缓解,第13天基本恢复正常(P＜0.01,表1,图1)。

表1 不同时相的大脑毛细血管内径周长Tab 1 Capillary luminal perimeter at different time points (±s)

vs.B group(the same time point)and C group,(1)P＜0.01；vs. A group(other time points),(2)P＜0.01.A：SAH group；B：Saline control group；C：Normal control group.

LSCM下毛细血管周细胞的形态变化LSCM扫描见周细胞分布于毛细血管周围,紧贴毛细血管外壁,胞质染为红色荧光(罗丹明),胞核染为蓝色荧光(DAPI)。二次注血后第3、5、7、9、11天,B、C组周细胞胞体荧光均匀,形态正常,紧贴毛细血管外壁,呈现扁长、舒展的形态,A组与B、C组相比,异常形态的周细胞数量增多(n=24,P＜0.05),周细胞胞体荧光不均匀,荧光信号减少或向中心聚集,失去正常舒展、扁长的形态,出现胞体聚缩改变(图2)。

脑组织切片病理形态观察B、C组脑组织形态正常,表现为染色均匀,组织结构清晰致密,神经细胞呈颗粒状、锥体状及不规则形,细胞质淡红色,胞核蓝染且轮廓清楚。二次注血后3、5、7、9、11天, A组见脑组织出现局部缺血病理形态,与B、C组相比神经元数量减少,呈变性坏死改变的细胞数量增多(n=24,P＜0.05),组织疏松,结构紊乱,与苏木精亲和力降低,胞核着色淡,神经胶质细胞相对增多,可见嗜神经现象及泡沫细胞(图3)。

讨 论

DIND是脑动脉瘤破裂SAH最严重的并发症［1］,多发于SAH后4～15天,7～10天为高峰期, 2～4周逐渐缓解,发病机制不明,是目前研究热点之一。大鼠枕大池二次注血SAH模型应用已有十余年,其制作方法简单、效果可靠,主要用来研究SAH后DCV及DIND的发病机制。枕大池二次注血后3～11天均有大鼠死亡,且存活大鼠有反应迟钝、主动攻击行为消失、饮水摄食活动减少等表现,脑组织切片HE染色可见局部缺血病理形态。结合临床上患者DIND的发病时间,我们推测大鼠枕大池二次注血后3～11天可能发生了DIND。

SAH后DIND的发病机制复杂,以往认为DIND的主要原因是DCV导致脑血流下降、脑缺血的结果。一项双盲、随机对照的临床研究显示, DCV的逆转并未改变患者的总体预后；也有学者认为大血管结构的改变如内膜增生、弹力层断裂、平滑肌细胞的增生等病理变化可能是DIND的主要原因,但仍不能解释临床上一些患者发病后的逆转过程［2,8-9］,因此其发病机制需要进一步研究。

有研究发现,内皮素受体拮抗剂Clazosentan虽然可以显著减少脑血管痉挛狭窄的发生,但其对SAH后DIND并没有任何改善或预防作用［9］,从而推论脑血管痉挛并不是导致DIND的唯一原因。Eberhard等［10］应用正交偏振光谱微循环成像方法(orthogonal polarization spectral imaging,OPS)在临床颅内动脉瘤手术中观察皮质微循环,显示发生SAH的患者较未发生SAH患者出现了明显的皮质浅层微血管痉挛。Pennings等［11］应用OPS观察到SAH患者皮质浅层微血管有高收缩反应性,提示脑微循环障碍可能在DIND中具有重要意义。

周细胞是毛细血管的主要收缩细胞,多位于组织毛细血管附近,紧邻内皮细胞基底面,与动、静脉血管平滑肌细胞连接,和内皮细胞构成微血管和组织间隙屏障,对微循环起重要的调控作用［6］。周细胞形态功能异常、微循环障碍后可导致脑血流降低、血脑屏障破坏等病理改变,进一步引起脑组织缺氧、神经细胞变性坏死而最终导致DIND。而微血管和周细胞在SAH后DIND发生时的动态变化鲜有报道。

LSCM是先进的生物学分析仪器,与免疫荧光生物学技术相配合,可以清晰地观察周细胞形态变化,并准确地进行毛细血管观察及管径测量。本实验将LSCM技术应用于大鼠SAH后DIND时大脑毛细血管内径周长变化及周细胞形态变化的动态研究,发现SAH后随着DIND严重程度的增加,大脑毛细血管管腔内径明显变小,之后随着DIND好转,毛细血管管腔内径逐渐恢复至正常；而且DIND发生后,周细胞外形失去正常的舒展平滑形态,出现胞体聚缩改变。这可能因为发生SAH后,随着血块中的红细胞破裂分解,释放出大量亚铁血红蛋白,导致神经元凋亡［12］,一氧化氮(NO)清除或产生减少,内皮素-1(ET-1)水平升高,平滑肌细胞应激反应增强［13］,产生过多的自由基和细胞膜脂质过氧化反应［14］,并发生钾离子和钙离子通道修饰以及特定基因和蛋白增量表达等［15］,继而引起周细胞形态功能异常、微循环障碍。这也可以解释我们实验中的发现,枕大池二次注血后第1天,周细胞形态功能异常、微循环障碍并不明显,可能与血块中的红细胞尚未破裂分解释放亚铁血红蛋白有关。

总之,我们的实验观察提示SAH后大脑毛细血管管腔狭窄、周细胞形态异常和DIND的发生密切相关,大脑毛细血管管腔狭窄、周细胞形态功能异常可能是DIND发生的关键因素。可以推测改善SAH后毛细血管管腔狭窄、维持周细胞正常形态功能,可能会减轻毛细血管血流减少和周细胞对毛细血管调节失常,从而减轻DIND。但DIND的发病机制复杂,还需进一步研究。

［1］ Dreier JP,Woitzik J,Fabricius M,et al.Delayed ischaemic neurological deficits after subarachnoid hemorrhage are associated with clusters of spreading depolarizations［J］. Brain,2006,129(12)：3224-3237.

［2］ Suarez JI,Tarr RW,Selman WR.Aneurysmal Subarachnoid hemorrhage［J］.N Engl J Med,2006,354：387-396.

［3］ Bosche B,Graf R,Ernestus RI,et al.Recurrent spreading depolarizations after subarachnoid hemorrhage decreases oxygen availability in human cerebral cortex［J］.Ann Neurol,2010,67(5)：607-617.

［4］ Castanares ZD,Hantson P.Pharmacological treatment of delayed cerebral ischemia and vasospasm in subarachnoid hemorrhage［J］.Ann Intensive Care,2011,1(1)：12.

［5］ Takashi S,Vikram J,Robert A,et al.Thrombin inhibition by argatroban ameliorates early brain injury and improves neurological outcomes after experimental subarachnoid hemorrhage in rats［J］.Stroke,2009,40(4)：1530-1532.

［6］ Lai CH,Kuo KH.The critical component to establish in vitro BBB model：Pericyte［J］.Brain Res Rev,2005,50 (2)：258-265.

［7］ Benakanakere I,Besch WC,Ellersieck MR,et al. Regression of progestin-accelerated 7,12-dimethylbenz［a］anthracene-induced mammary tumors in Sprague-Dawley rats by p53 reactivation and induction of massive apoptosis：a pilot study［J］.Endocr Ralat Cancer,2009,16 (1)：85-98.

［8］ Hansen SJ,Vajkoczy P,Macdonald RL,et al.Cerebral vasospasm：looking beyond vasoconstriction［J］.Trends Pharmacol Sci,2007,28(6)：252-256.

［9］ Pluta RM,Schwartz JH,Dreier J,et al.Cerebral vasospasm following subarachnoid hemorrhage：Time for a new world of thought［J］.Neurol Res,2009,31(2)：151 -158.

［10］ Eberhard U,Lehmberg J,Steiger HJ,et al.Intraoperative detection of early microvasospasm in patients with subarachnoid hemorrhage by using orthogonal polarization spectral imaging［J］.Neurosurgery,2003,52(6)：1307 -1317.

［11］ Pennings FA,Bouma GJ,Ince C.Direct observation of the human cerebral microcirculation during aneurysm surgery reveals increased arteriolar contractility［J］.Stroke,2004, 35(6)：1284-1288.

［12］ Cahill WJ,Calvert JH,Zhang JH.Mechanisms of early brain injury after subarachnoid hemorrhage［J］.J Cereb Blood Flow Metab,2006,26(11)：1341-1353.

［13］ Kikkawa Y,Matsuo S,Kameda K,et al.Mechanisms underlying potentiation of endothelin-1-induced myofilament Ca2+sensitization after subarachnoid hemorrhage［J］.J Cereb Blood Flow Metab,2012,32(2)：341-352.

［14］ Echigo R,Shimohata N,Karatsu K,et al.Trehalose treatment suppresses inflammation,oxidative stress,and vasospasm induced by experimental subarachnoid hemorrhage［J］.J Transl Med,2012,10：80.

［15］ Jackson1 WF.Altered expression and function of ryanodine receptors and FKBP12.6 after subarachnoid hemorrhage：more than meets the eye［J］.J Cereb Blood Flow Metab,2011,31(1)：1-2.

Relationship between delayed ischemic neurological deficit（DIND）after subarachnoid hemorrhage（SAH）and changes of brain capillaries in rats

GUO Hui1,2,LI Yun-hong2,3,GAO Peng2,ZHAO Wei2,3,SHEN Bing1△
(1Department of Neurosurgery,General Hospital of Ningxia Medical University,Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region,China；2Gradate School,3Medical Sci-Tech Research Center, Ningxia Medical University,Yinchuan 750004,Ningxia Hui Autonomous Region,China)

Objective To observe the relationship between ischemic neurological deficit(DIND)and changes of capillaries and pericytes of brain by laser scanning confocal microscope(LSCM)in rats after subarachnoid hemorrhage(SAH).MethodsOne hundred and eighty SD rats were randomlydivided into SAH group(A group,n=84),saline-control group(B group,n=84)and normal control group(C group,n=12).The SAH model was developed in A group with twice injections of 0.3 m L arterial blood into cisterna magna,and 0.3 m L saline for B group.In A and B groups,12 brains were harvested 1,3,5,7,9,11 and 13 days after the second blood injected respectively,and every time 6 rats with fluorescein isothiocyanate(FITC)-conjugated tomato lectin perfused for capillary luminal perimeter and shapes of pericytes by LSCM,another 6 for desmin by immunofluorescence staining and pathomorphological changes of brain tissue by hematoxylin-eosin staining.Six brains of normal control group were used for the same methods.ResultsIn A group,ischemic pathomorphological changes including disordered tissue construction,edema of interstitial substance,degeneration and necrosis of neurons in brain tissue were identified from 3 to 11 days.In B and C groups,there was no ischemic pathomorphological changes in brains at different time points.Compared with B group,stenosis of capillary luminal appeared on the 3rdday,reached the peak on the 5thday and continued to the 7thday, then gradually diminished and returned to normal control perimeter on the 13thday in A group. Compared with B and C groups,condensation changes of pericytes in A group were observed at different time points(P＜0.05).ConclusionsOur results suggested that stenosis of capillary luminal and morphological abnormalities of pericytes in brain may be significantly associated with the delayed ischemic neurological deficit after subarachnoid hemorrhage.

subarachnoid hemorrhage(SAH)； delayed ischemic neurological deficit(DIND)；capillary； pericyte； laser scanning confocal microscope(LSCM)； rats

R 743.35

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2014.01.008

2012-11-26；编辑：王蔚)

宁夏自然科学基金(NZ10136)

△Corresponding author E-mail：shenbing315@sina.com

*This work was supported by the Natural Science Foundation of Ningxia Hui Autonomous Region(NZ10136).