去铁胺（DFO）诱导骨髓增生异常综合征（MDS）细胞株SKM-1的P15INK 4B基因去甲基化

丁倩倩 陈勤奋 王小钦

（复旦大学附属华山医院血液科 上海 200040）

骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndr o me，MDS）是起源于造血干细胞的克隆性疾病，表现为粒系、红系和巨核细胞系一系或多系发育异常和无效造血导致外周血一系或多系血细胞计数减少，其转归是骨髓衰竭或演变为急性髓性白血病（acute myeloid leukemia，A ML）。近年来，MDS的表观遗传改变和铁过载危害成为研究热点。DNA异常甲基化是目前研究最多的MDS表观遗传改变，其中P15INK4B基因启动子区Cp G岛的高度甲基化在血液系统肿瘤出现频繁［1]，与 MDS的发生发展及转化为AML密切相关［2]，启动子区的高度甲基化可导致该抑癌基因失活［3－4]。同时，MDS患者由于骨髓无效造血反馈性刺激肠道铁吸收增多以及反复红细胞输注等原因，导致铁过载（iron overload），造成重要脏器损害，加速白血病的转化，抑制造血功能，因此铁过载是MDS总生存（overall survival，OS）和无白血病生存的一个独立预后因素［5－6]。除了去甲基化治疗外，去铁治疗已被列入多个治疗指南［5]。最新研究表明，在去甲基化治疗前使血清铁蛋白（serum ferritin，SF）降至1 000μg／L以下，可获得更高的总体反应率（overall response，OR）和OS［7]。本研究首次采用铁螯合剂去铁胺（def er oxa mine，DFO）诱导铁过载的 MDS细胞株SK M-1 P15INK4B基因去甲基化，以探讨去铁对MDS的治疗作用，国内外尚未见报道。

材料和方法

研究对象 MDS细胞株SK M-1来源于1名MDS-RAEBT转化为A ML-M5的76岁男性患者的外周血，由本科室保存。SK M-1是研究MDS发生、发展、DNA重排改变以及基因不稳定性的理想细胞株，呈淋巴细胞形态，强烈表达髓过氧化物酶［8－9]。

细胞培养及分组 SK M-1细胞在含10%灭活胎牛血清的RPMI 1640培养液（美国Hy Cl one公司）于37℃、5%CO2培养箱（美国Ther mo公司）中培养。取对数生长期细胞，以1×106／ml密度接种于12孔板，1 ml／孔，分为3组（每组3复孔），分别为对照组、枸橼酸铁铵（ferric ammoiu m citrate，FAC）组和FAC＋DFO组。其中对照组不加FAC和DFO培养48 h；FAC组加入400μmol／L FAC（美国Sigma公司）培养48 h，使SK M-1细胞铁过载；FAC＋DFO组加入400μmol／L FAC培养24 h后，换用含100μmol／L DFO（瑞士Novartis公司）的培养液继续培养24 h，以对铁过载的SK M-1细胞进行去铁处理。3组分别收集细胞备用。

细胞内可变铁池（labile iron pool，LIP）的检测 采用Calcein-A M单染法检测LIP。收集3组细胞，无血清RPMI 1640培养液洗涤2次，调节细胞密度为1×106／ml，加入 Calcein-AM （美国 Sigma公司），终浓度为0.125μmol／L，37℃、5%CO2培养箱中孵育5 min，RPMI 1640培养液洗涤2次，流式细胞仪（美国BD公司）检测平均荧光强度（mean fluorescence intensity，MFI）。以对照组为基线，用MFI下降的百分比即相对荧光淬灭率反映LIP的相对水平，LIP （%）＝ （MFI对照组－MFI实验组／MFI对照组）×100%。

细胞内活性氧类（reactive oxygen species，ROS）的检测 收集3组细胞，调节细胞密度为1×106／ml，按ROS检测试剂盒（上海碧云天公司）说明进行操作，流式细胞仪检测 MFI。荧光探针DCFHDA本身没有荧光，可自由穿过细胞膜进入细胞内，酯酶水解生成DCFH。DCFH不能通透细胞膜，探针很容易被装载到细胞内。细胞内的ROS可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。DCF的荧光强度与细胞内ROS水平成正比。

P15INK4B基因甲基化的检测 采用甲基化特异性PCR（MSP）法检测P15INK4B基因的甲基化水平。收集3组细胞，按DNA提取试剂盒（德国Qiagen公司）说明提取DNA，按甲基化修饰试剂盒（美国Zy mo公司）说明用亚硫酸氢钠修饰DNA，经乙醇沉淀回收重悬于溶解液中。分别用甲基化（M）和非甲基化（U）两种引物进行扩增。引物序列见表1。PCR反应条件：95℃变性10 min，95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，扩增40个循环，最后一次72℃延伸7 min。PCR反应总体系25μL，包括：Zy mo TaqTMPre Mix 12.5μL，正向引物（浓度20μmol／L）0.5μL，反向引物（20μmol／L）0.5 μL，DNA 2μL，dd H2O 9.5μL。取5μL扩增产物，6×加样缓冲液1μL，3.0% 琼脂糖胶100 V电泳，UVP凝胶成像系统观察结果并照相。空白对照为不加DNA的dd H2O。

表1 P15INK 4B引物序列Tab 1 Pri mer sequences of P15 INK 4B

P15INK4B基因mRNA的检测 采用实时荧光PCR （real-ti me fluorescent PCR）相对定量法，以GAPDH为内参，计算各样品的ΔCt（目的基因Ct值－GAPDH基因Ct值），以表达最低样本作为校正样品，计算RQ值，公式：RQ＝2－（样品的ΔCt－校正品ΔCt）。引物由上海生工公司通过Pri mer 5.0软件设计合成（表2）。PCR反应条件：95℃预变性30 s，95℃30 s，60℃ 34 s，共40个循环，72 ℃灭活5 min，PCR产物4℃保存。PCR反应体系按照Ta Ka Ra公司说明书配制，2×SYBR Premix Ex Taq 10μL，Rox DyeⅡ0.4μL，正向引物0.4μL，反向引物0.4μL，c DNA 2μL，双蒸水6.8μL。每一个样本均设3个复孔，计算平均值作为RQ值。

表2 P15 INK 4B和GAPDH引物序列Tab 2 Pri mer sequences of P15 INK 4B and GAPDH

细胞增殖的检测 采用羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（carboxy fluorescein diacetate succini midyl ester，CFDASE，简称CFSE）法。收集3组细胞，调节细胞密度为1×106／ml，按CFSE细胞增殖与示踪检测试剂盒（日本Dojindo公司）说明操作，流式细胞仪检测MFI。CFSE是一种可穿透细胞膜的荧光染料，进入细胞后不可逆地与细胞内的氨基结合偶联到细胞蛋白质上。当细胞分裂时，CFSE标记的荧光平均分配至2个子代细胞中，其MFI是亲代细胞的一半，随传代而衰减。

细胞早期凋亡的检测 采用Annexin V-FITC单染法。收集3组细胞，调节细胞密度为1×106／ml，按Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒（美国BD公司）说明操作，加入5μL Annexin V-FITC，室温避光反应20 min，立即进行流式细胞仪检测。

细胞周期的检测 采用碘化丙啶（PI）单染法检测细胞周期。收集3组细胞，PBS洗涤，加入预冷的70%乙醇（PBS配制），于4℃固定过夜，1 200 r／min离心5 min（离心半径13.5cm），弃上清，PBS洗涤，调节细胞密度为1×106／ml，取100μL，加入RN ase A酶，终浓度为1 mg／ml，混匀后37℃水浴30 min，加入PI综合染液（美国 Molecular Pr obes公司），终浓度为50μg／ml，混匀，流式细胞仪检测。

统计学处理 采用SPSS 16.0统计软件进行分析，计量资料以±s表示，两组间比较采用配对t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

不同铁负荷组细胞内的LIP 与对照组相比，FAC组和FAC＋DFO组的LIP均明显升高，差异有统计学意义（F＝10.60，P＜0.001；F＝41.79，P＝0.0485）；与FAC组相比，FAC＋DFO组的LIP明显降低，差异有统计学意义（F＝3.942，P＜0.0001）。说明FAC使SK M-1细胞铁负荷增加，DFO则使铁负荷下降（图1、表3）。

图1 不同铁负荷组细胞内LIPFig 1 Cellular LIP of different iron loading groups

表3 不同铁负荷组的检测结果Tab 1 Detection results of different iron loading groups （±s）

表3 不同铁负荷组的检测结果Tab 1 Detection results of different iron loading groups （±s）

Group LIP（%）ROS（MFI，%）mRNA（d R）Pr oliferation（MFI，%）Early apoptosis rate（%）Cell cycle（%）G1 S G2 Control 1.45±0.65 33.38±12.96 1 51.67±1.61 22.53±1.76 55.78±3.61 44.22±3.610 FAC 64.04±2.12 45.57±1.18 0.72±0.08 23.01±5.20 13.97±2.25 50.22±9.20 49.77±9.20 0 FAC＋DFO 8.34±4.21 34.39±2.12 1.50±0.15 37.34±6.61 55.07±1.30 51.10±6.30 48.90±6.300

不同铁负荷组细胞内的ROS 与对照组相比，FAC组的ROS明显升高，差异有统计学意义（F＝6.016，P＝0.0025）；FAC＋DFO组的ROS无明显升高，差异无统计学意义（F＝2.541，P＝0.764）。与FAC组相比，FAC＋DFO组的ROS明显降低，差异有统计学意义（F＝15.29，P＝0.0154）。说明随着铁负荷增减，细胞内ROS水平也有所增减，DFO在使铁负荷下降的同时，降低SK M-1细胞内ROS水平（图2、表3）。

图2 不同铁负荷组细胞内ROSFig 2 Cellular ROS of different iron loading groups

不同铁负荷组细胞的P15INK4B基因甲基化情况电泳图显示，对照组的SKM-1细胞呈现明显甲基化，未出现非甲基化条带；FAC组的甲基化条带略淡，但未出现非甲基化条带；FAC＋DFO组的甲基化条带明显变淡，并出现非甲基化条带（图3）。

图3 不同铁负荷组细胞P15INK 4B基因甲基化状态电泳图Fig 3 The electr ophotogram of P15INK 4B gene methylation state in different ir on loading groups

不同铁负荷组细胞的P15INK4B基因mRNA表达情况 与对照组相比，FAC组的P15INK4B基因mRNA表达水平下降（F＝2.2 6 5，P＝0.0274），FAC＋DFO组的表达水平升高（F＝1.483，P＝0.0117），差异均有统计学意义（P＜0.05），说明铁过载抑制了P15INK4B基因的表达，而去铁可使P15INK4B基因重新表达（图4、表3）。

不同铁负荷组细胞的增殖情况 与对照组相比，FAC组和FAC＋DFO组CFSE的MFI均减少（F＝10.42，P＝0.0008；F＝16.84，P＝0.0218），差异均有统计学意义（P＜0.05），说明两组细胞均有增殖。但与FAC组相比，FAC＋DFO组CFSE的MFI升高，差异有统计学意义（F＝1.617，P＝0.0419），说明加入DFO后部分抑制了铁过载SKM-1细胞的增殖（图5、表3）。

图4 不同铁负荷组细胞P15 INK 4B基因mRNA表达电泳图Fig 4 The electrophotogram of P15 INK 4B gene mRNA expression in different iron loading groups

图5 不同铁负荷组细胞CFSE的MFIFig 5 MFI of CFSE in different iron loading groups

不同铁负荷组细胞的早期凋亡情况 与对照组相比，FAC组早期凋亡率减少（F＝1.628，P＝0.04），FAC＋DFO组早期凋亡率增加（F＝1.845，P＜0.001），差异均有统计学意义（P＜0.05）；与FAC组相比，FAC＋DFO组早期凋亡率明显增加，差异有统计学意义（F＝3.005，P＜0.001）。说明铁负荷抑制SK M-1细胞的凋亡，而去铁能促进SK M-1细胞的凋亡（图6、表3）。

图6 不同铁负荷组细胞的早期凋亡率Fig 6 Early apoptosis rate in different iron loading groups

不同铁负荷组细胞的细胞周期 与对照组相比，FAC组和FAC＋DFO组G1期细胞比例有下降，S期细胞比例有升高（F＝6.486，P＝0.386；F＝3.040，P＝0.326），但差异无统计学意义 （P＞0.05），说明铁负荷对SK M-1细胞周期无明显作用（图7、表3）。

图7 不同铁负荷组细胞的细胞周期Fig 7 The cell cycle in different iron loading gr oups

讨 论

近年来对MDS的诊断、分型和预后判断有较大的进展，而治疗上或以支持治疗为主，或借鉴A ML化疗方案。直至2004年以后，由美国FDA批准的DNA甲基转移酶（DNA met hyltransferase，DNMT）抑制剂阿扎胞苷（5-azacitidine，5-AZA，5-氮胞苷）和地西他滨 （5-aza-2′-deoxycytidine，Decitabine，DAC，5-氮杂-2′-脱氧胞苷）、新型口服铁螯合剂地拉罗司（Deferasir ox，DFX）以及免疫调节剂雷利度胺（lenalidomide）陆续上市，才改变了长期以来MDS治疗的无针对性状况。P15INK4B基因高度甲基化是较早被证明存在于MDS中的表观遗传改变［10]，在初发以及疾病进展中均可被检测到，并且与转化为白血病高度相关［2，11]。该异常可被DNMT抑制剂所逆转，在DAC治疗后，原本因高度甲基化而静默的P15INK4B基因重新表达［12]。但是相比DNMT抑制剂的广泛应用以及对MDS抑癌基因去甲基化的密切关注和研究［13]，MDS的去铁治疗尚未得到很大的关注［5]。

研究发现，约80%的MDS患者早期表现为贫血，通过肠道代偿性吸收过多的铁以满足造血需要，超过40%的患者最终进展为输血依赖［14]。因此，铁过载在MDS患者中普遍存在。在MDS的预后评分系统中发现，红细胞输注依赖和铁过载不仅导致器官损害，而且直接损害造血系统功能，对病程产生影响，因此 WHO在国际预后评分系统（IPSS）［15]中增加了贫血和红细胞输注依赖指标，形成了WHO预后 评分系统 （WPSS）［16]。Delgado 等［7]研 究 发现，去铁治疗可以提高DNMT抑制剂的疗效。

本研究为避开MDS的异质性，选用MDS细胞株SKM-1作为研究对象，参考文献［17]，一方面，用FAC使SK M-1细胞LIP明显升高，造成铁过载，诱导ROS明显升高，同时，抑癌基因P15INK4B的mRNA表达水平明显下降，SK M-1细胞增殖明显，凋亡受抑；另一方面，在SK M-1细胞铁过载的基础上，用临床常用的铁螯合剂DFO进行去铁，发现LIP明显下降，ROS也随之明显降低，同时，抑癌基因P15INK4B的mRNA表达水平明显上调，抑制了SK M-1细胞的增殖，促进了其凋亡。提示DFO可诱导铁过载的SK M-1细胞P15INK4B基因去甲基化，使其重新表达，并可抑制铁过载的SKM-1细胞增殖，促进其凋亡。临床上可能与DNMT抑制剂有协同作用。

目前临床上DNMT抑制剂有2种：5-AZA和DAC，铁螯合剂有3种：DFO、去铁酮（deferiprone，DFP）和DFX，在中国批准用于MDS铁过载治疗的是DFO和DFX［18]。表观遗传学修饰治疗和去铁治疗最近已被纳入我国的 MDS治疗专家共识［19]，正改善着MDS的自然病程和预后。本研究为表观遗传学修饰治疗和去铁治疗协同应用于MDS治疗提供了基础理论依据。

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