CUGBP1在人肺腺癌组织和细胞中的表达

,,,,,

(1 青岛大学医学院组织胚胎学教研室，山东 青岛 266021； 2 北京协和医学院中国医学科学院肿瘤医院)

CUGBP1在人肺腺癌组织和细胞中的表达

张静1,曹留霞1,于舒飞2,刘晓萍1,陈琛1,卞晶晶1

(1 青岛大学医学院组织胚胎学教研室，山东 青岛 266021； 2 北京协和医学院中国医学科学院肿瘤医院)

目的比较分析CUGBP1基因在人肺腺癌组织和细胞内表达的特点，及其CUGBP1表达水平与癌细胞增殖活性的关系。方法以人肺腺癌组织标本和人肺腺癌细胞株A549为研究对象，应用免疫组化、Western Blot、RT-PCR方法检测人肺腺癌组织、细胞内CUGBP1蛋白和基因的表达，并分析其特点。结果CUGBP1基因主要在人肺腺癌组织的细胞核呈强阳性表达，在所有类型腺癌组织中80%以上的癌巢细胞CUGBP1基因呈阳性表达，阳性表达率明显高于正常对照组，差异有显著性(t′=100.01,P<0.001)。95%以上的A549细胞CUGBP1表达呈阳性，且CUGBP1表达量明显低于LPS组,差异有显著性(t=407.53,P<0.001)。结论CUGBP1基因在人肺腺癌癌巢细胞和A549细胞的胞核内高表达；炎性刺激可增强人肺腺癌细胞株A549的增殖和CUGBP1基因表达；CUGBP1基因可能成为人肺腺癌的早期诊断和增殖状态判断的新指标。

肺肿瘤；人肺腺癌细胞株A549；基因，CUGBP1；脂多糖类

已有研究结果表明，大约25%的成人肿瘤是由慢性炎症而引起[1]。因此，炎症被称为“癌症的第七大特征”[2]。CUGBP1作为CELF 家族的创始成员，其作用主要集中于对RNA的可变剪切、mRNA的翻译和mRNA的降解调控等，并对机体正常发育和某些疾病的发生起着重要的作用[3-5]，但其与肺癌发生的关系，迄今仅有个别报道[6]。本实验选择人肺腺癌组织和A549细胞作为研究对象，从蛋白和核酸水平探究CUGBP1在人肺腺癌组织和细胞中的表达，探讨其炎性因子脂多糖(LPS)诱导对人肺腺癌细胞增殖和CUGBP1表达的关系。以期寻找早期诊断人肺腺癌和有效反映人肺腺癌组织细胞增殖和迁移活性的指标。现将结果报告如下。

1 材料和方法

1.1材料来源

我院附属医院病理科人肺腺癌组织及正常对照癌旁组织标本50例。由病理科3名资深的医师联合做出病理诊断，确诊为肺腺癌，并且具有完整的临床资料，正常对照癌旁组织为距离癌病灶3～5 cm处的组织。人肺腺癌细胞系A549由我院附属医院中心实验室提供。

1.2主要试剂

LPS购自美国Sigma公司。改良型RPMI 1640培养液及胎牛血清为Hyclone公司产品；兔抗人CUGBP1多克隆抗体购自英国Abcom公司；PV-9000二抗试剂盒和DAB显色试剂盒均购自北京博奥森有限公司；RT-PCR Trizol试剂、cDNA合成试剂盒和premix ex taq均购自TaKaRa公司。

1.3引物

引物由上海生工生物工程有限公司合成，其中用于RT-PCR的目的基因CUGBP1引物序列：上游引物5′-ACCAGAATCTTCTGACACAGCA-3′，下游引物5′-CAAAACCAAAACACTTGCTCAG-3′。以GAPDH为内参照，GAPDH上游引物5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′，下游引物5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。

1.4肺癌标本的收集

将新鲜标本一部分用甲醛固定、石蜡包埋，进行免疫组化染色。另一部分放入DEPC处理过的Eppendorf管中至液氮片刻，随后放入-80 ℃冰箱保存,备用于总RNA和总蛋白提取。

1.5人肺癌及癌旁组织CUGBP1蛋白的检测

1.5.1免疫组化检测 按PV-9000说明书进行免疫组化染色(一抗为1∶100的CUGBP1，PBS代替一抗作为阴性对照)，DAB显色，苏木精复染。计数CUGBP1蛋白阳性表达率。

1.5.2蛋白质印迹法检测 裂解组织，提取总蛋白，紫外线分光光度法测定蛋白浓度。SDS-PAGE电泳分离总蛋白，分离胶浓度为125 g/L；然后电转移至PVDF膜上，然后按试剂盒说明书进行操作，一抗CUGBP1(1∶10 000)、GAPDH(1∶2 000),HRP-二抗(1∶1 000稀释),显影。实验重复3次，拍照并记录。

1.6人肺癌及癌旁组织CUGBP1 mRNA 检测

以Trizol提取组织总RNA，紫外线分析测定所提 RNA浓度。根据TaKaRa公司的逆转录说明书操作逆转录反应生成cDNA。然后进行PCR扩增反应。PCR反应体系共20 μL，其中premix ex taq 10 μL、10 μmoL/L上游引物0.8 μL、10 μmoL/L下游引物0.8 μL、cDNA 2.0 μL、水 6.4 μL。各组以95 ℃变性5 min，按下列条件扩增：CUGBP1：98 ℃、10 s，60 ℃、30 s，72 ℃、30 s，35个循环。GAPDH：98 ℃、10 s，56 ℃、30 s，72 ℃、30 s；然后72 ℃延伸10 min。产物于20 g/L的琼脂糖凝胶中以120 V电压电泳，紫外线下观察，凝胶成像仪照相，Quantity One软件分析条带吸光度(A)值。

1.7LPS刺激的人肺腺癌A549细胞的活性测定

取处于对数生长期A549细胞,以含体积分数0.10胎牛血清的RPMI 1640培养液调细胞密度为5×106/L后，接种于96孔培养板，每孔180 μL，常规培养12 h，随机分为对照组和LPS组，LPS组加LPS终浓度为25 mg/L，对照组加等量营养液。每组设5个复孔，培养24 h。于终止实验前4 h每孔加5 g/L MTT液20 μL，继续培养4 h。小心吸弃150 μL上清液，每孔加入150 μL DMSO,轻轻振荡10 min，酶标仪测定波长490 nm处各孔A值。

1.8LPS刺激的人肺腺癌A549细胞中CUGBP1蛋白的表达

1.8.1免疫细胞化学检测 将处于对数生长期的A549细胞接种于6孔板中培养(部分孔内预先置有小玻片),待细胞达到80%～85%融合时，随机分为对照组(等量营养液)和LPS组(终浓度25 mg/L)，24 h后收集小玻片，PBS洗3次，多聚甲醛固定，按1.4步骤进行免疫组化染色，计算CUGBP1阳性表达率和强度，用Image-pro Plus软件对阳性信号的强度定量分析；另一部分细胞提取总蛋白。

1.8.2蛋白质印迹法检测 参照1.4的方法。

2 结 果

2.1人肺腺癌和正常对照组织中CUGBP1蛋白和基因的表达

CUGBP1蛋白阳性反应呈黄色或棕褐色颗粒，主要表达于肺腺癌组织的癌巢上皮细胞核中。中分化管状腺癌间质成分较多，肺腺癌细胞呈高柱状，沿肺泡腔扩散，形成腺样结构；低分化腺癌腺泡密集，分化程度低。细支气管肺泡腺癌，癌细胞沿肺泡壁呈多层生长，肺泡壁增厚，癌细胞呈立方形或矮柱状；支气管腺型腺癌腺腔内含有黏液；腺鳞癌癌巢内见低分化鳞状细胞癌成分及由柱状上皮组成的腺癌成分。所有腺癌样本组织均可见CUGBP1蛋白阳性表达，CUGBP1蛋白阳性细胞占癌细胞的80%以上。而不同个体同种类型的腺癌标本CUGBP1蛋白阳性百分率和表达强度均有所差异；癌旁组织可见终末细支气管上皮的细胞核呈阳性表达,尘细胞CUGBP1蛋白呈阴性表达。肺癌组织CUGBP1蛋白表达阳性率为(80±3)%，对照组为(29±2)%，两者比较差异有显著性(t′=100.01,P<0.001)。

CUGBP1电泳带显示，肺癌组织CUGBP1基因表达量为42.35±2.14，对照组为19.14±1.15,两者比较差异有显著性(t=16.55,P<0.001)。

2.2LPS孵育对A549细胞增殖活性和CUGBP1蛋白表达的影响

MTT检测结果显示，LPS孵育可以显著增强A549细胞的增殖活性((0.69±0.01)A)，与对照组((0.48±0.02)A)相比，差异有显著意义(t=16.27,P<0.001)。免疫细胞化学染色显示，A549细胞贴壁生长，95%以上细胞内CUGBP1表达呈阳性，且CUGBP1表达量(849.65±4.15)明显低于LPS组(2 003.58±2.79),差异有显著意义(t=407.53,P<0.001)。Western Blot检测结果也显示，LPS孵育A549细胞内CUGBP1蛋白表达量(78.25±2.47)较正常对照组(20.52±3.56)明显增加,差异有显著性(t=16.95,P<0.001)。肺癌组织CUGBP1蛋白表达量((65.35±2.35)A)较正常对照组((27.36±3.45)A)也明显增加，差异有显著性(t=16.95,P<0.001)。

3 讨 论

近半个世纪以来，随着工业化的发展，肺癌发病率和死亡率一直呈明显上升趋势。非小细胞肺癌(NSCLC)进展迅速，通常就诊时有转移或已到晚期，对化疗不敏感，预后差，早期诊断是决定肺癌治疗、延长病人生命的关键。目前尚无确切标志物及早期诊断指标。因此，寻找早期诊断NSCLC的标志物，探讨肺癌标志物与癌细胞增殖的关系，将为肺癌早期诊断和有效治疗提供有价值的依据[7-8]。

CUGBP1作为RNA结合蛋白，参与了多种人类肿瘤的发生和发展。有研究认为，上调CUGBP1可以降低CD9 基因水平。而CD9表达降低与前列腺癌、乳癌、结肠癌、非小细胞肺癌、口腔鳞癌、急性髓细胞白血病及B型淋巴细胞白血病等多种肿瘤的恶化及全身转移相关[9-10]。认为CUGBP1 通过调节CD9，发挥促进细胞增殖及 DNA 合成、促进细胞周期进程、抑制细胞凋亡，进而促进肿瘤发生发展的癌基因样作用。目前尚不清楚不同类型肺腺癌组织、癌旁组织细胞中CUGBP1表达的形态学特点和差异性。本实验结果显示，CUGBP1在肺腺癌病人的癌旁组织内的终末细支气管上皮细胞的胞核呈阳性表达，而在癌周和肺泡隔的结缔组织细胞、尘细胞中呈阴性表达。体外培养观察到90%以上的人肺腺癌细胞株A549细胞的胞质和胞核CUGBP1表达呈阳性，其胞核内表达更显著。

目前，越来越多的证据表明，炎性反应与肿瘤的发生发展密切相关。研究认为炎症部位的细胞因子、趋化因子的持续存在和由其引发的级联反应能够诱导细胞的增殖,趋化炎症细胞的聚集,增加活性氧产物的产生,导致DNA氧化损伤。有DNA损伤或发生了基因突变的增殖细胞在富含炎症细胞和多种生物因子的微环境中继续失控性增殖,修复程序混乱,最终导致癌变[11]。本实验结果显示，炎性启动因子LPS可促进A549细胞增殖，几乎所有A549细胞CUGBP1表达均明显增强。提示CUGBP1基因高表达与炎性刺激、癌细胞增殖有关，进而表明CUGBP1可能作为判断肺腺癌增殖活性的一个有效指标。本研究探讨人肺腺癌细胞中CUGBP1表达与癌细胞增殖的关系，将为其用于肺癌的早期诊断、预防和治疗效果的判断提供实验依据。然而，本研究结果显示，在癌旁组织内的终末细支气管部分上皮细胞的胞核内CUGBP1也为阳性表达，这些细胞是处于正常、还是在癌变中尚待深入探讨。

[1] BALKWILL F, MALLTOVANI A. Inflammation and cancer: back to virchow [J]. Lancet, 2001,357(9255):539-545.

[2] MANTOVANI A, AUAVENA P, SICA A, et al. Cancel-related inflammation [J]. Nature, 2008,454(7203):436-444.

[3] LEE J E, LEE J Y, WILUSZ J, et al. Systematic analysis of cis-elements in unstable mRNAs demonstrates that CUGBP1 is a key regulator of mRNA decay in muscle cells [J]. PLoS One, 2010,5(6):11201.

[4] VLASOVA I A, TAHOE N M, FAN D, et al. Conserved GU-rich elements mediate mRNA decay by binding to CUG-binding protein 1 [J]. Mol Cell, 2008,29(2):263-270.

[5] ZHANG L, LEE J E, WILUSZ J, et al. The RNA-binding protein CUGBP1 regulates stability of tumor necrosis factor mRNA in muscle cells: implications for myotonic dystrophy [J]. Biol Chem, 2008,283(33):22457-22463.

[6] JIAO W, ZHAO J, WANG M, et al. CUG-binding protein 1 (CUGBP1) expression and prognosis of non-small cell lung cancer[J]. Clin Transl Oncol, 2013,15(10):789-795.

[7] 赵淑芳,梁辉. 肺癌病人血清降钙素水平的检测及其意义[J]. 齐鲁医学杂志, 2011,26(4):293-294.

[8] 王冠群,陈桦. 肺癌A549细胞P物质和NK-1表达SR140333对其影响[J]. 齐鲁医学杂志, 2011,26(3):211-213.

[9] WANG J C, BEGIN LR, BERUBE N G, et al. Down-regulation of CD9 expression during prostate carcinoma progression is associated with CD9 mRNA modifications [J]. Clin Cancer Res, 2007,13(8):2354-2361.

[10] GANDEMER V, RIO AG, DE TAYRAC M, et al. Five distinct biological processes and 14 differentially expressed genes characterize TEL/AML1-positive leukemia[J]. BMC Geno-mics, 2007,8:385.

[11] SCOTT H R, MCMILLAN D C, FORREST L M, et al. The systemic inflammatory response, weight loss, performance status and survival in patients with inoperable non-small cell lung cancer [J]. Br J Cancel, 2002,87(3):264-267.

(本文编辑 厉建强)

EXPRESSIONOFCUGBP1INHUMANLUNGADENOCARCINOMATISSUEANDCELLS

ZHANGJing,CAOLiuxia,YUShufei,LIUXiaoping,CHENChen,BIANJingjing

(Department of Histology and Embryology, Qingdao University Medical College, Qingdao 266021, China)

ObjectiveTo compare and analyze the characteristics of CUGBP1 gene expression in human lung adenocarcinoma (LAC) tissue and in its cells, and the relationship between the expression level and the proliferation activity of the cancer cells.MethodsThe specimens of human LAC tissue and LAC A549 served as the object of research. The CUGBP1 protein and mRNA expression in the tissue and cells were detected by immunohistochemistry, Western Blot and RT-PCR method, their cha-racteristics were analyze as well.ResultsUGBP1 genes showed strongly positive expression mainly in nuclei of human LAC tissue. In all types of adenocarcinoma tissues,80% of CUGBP1 gene expression in cancer cell nest were positive, which were obviously higher than the control (t′=100.01,P<0.001), and more than 95% of CUGBP1 expression in A549 were positive, cell CUGBP1 expression of 95% of A549 cells was positive, and the expression level of CUGBP1 was significantly lower than that in LPS group (t=407.53,P<0.001).ConclusionHigh expressions of CUGBP1 genes were noted in human lung adenocarcinoma cells and nuclei of A549 cells. Inflammatory stimulus can enhance the proliferation of A549 and expression of UGBP1. CUGBP1 gene is likely to become a new marker for early diagnosis of lung adenocarcinoma and proliferation status of the disease.

lung neoplasms; human lung neoplasms A549 cells; gene, CUGBP1; lipopolysaccharides

2013-10-16;

2014-04-11

山东省自然科学基金资助课题(ZR2012CM008)

张静(1987-)，女，硕士研究生。

刘晓萍(1957-)，女，教授，硕士生导师。E-mail:xplyu2008@126.com。

R734.2

A

1008-0341(2014)03-0207-03