淫羊藿素抗骨肉瘤的机制探究

刘玉亮， 殷嫦嫦， 张义平， 梁广胜， 魏强强， 殷 明

（1.南昌大学第二附属医院骨一科， 江西 南昌 330006； 2.南昌大学研究生院医学部， 江西 南昌 330006；3.九江学院医学部分析与检测实验室， 江西 九江 332000）

淫羊藿素抗骨肉瘤的机制探究

刘玉亮1，2， 殷嫦嫦3， 张义平3， 梁广胜1，2， 魏强强1，2， 殷 明1*

（1.南昌大学第二附属医院骨一科， 江西 南昌 330006； 2.南昌大学研究生院医学部， 江西 南昌 330006；3.九江学院医学部分析与检测实验室， 江西 九江 332000）

目的 探讨淫羊藿素致 Saos2 细胞凋亡及抑制其增殖的可能机制。 方法 采用不同质量浓度梯度淫羊藿素作用于人骨肉瘤 Saos2 细胞及用抗氧化剂预处理过的骨肉瘤细胞， 倒置相差显微镜观察细胞形态； 流式细胞仪检测不同条件下细胞活性氧的情况及凋亡情况； 划痕实验检测淫羊藿素对细胞增殖迁移的影响； 用终浓度为 100 μmol/L的氯化钴模拟骨肉瘤的缺氧环境， RT-PCR检测血管内皮生长因子 （VEGF）、 尿激酶型纤溶酶原激活剂受体 （ uPAR）、 基质金属蛋白酶 2 （ MMP2） 、 肾上腺髓质素 （ ADM） 、 烯醇酶-1 （ Enolase-1 ） 及醛缩 酶 A （ aldolase A） 基因 表达的情况。结果 淫羊藿素作用后的骨肉瘤细胞活性氧水平较阴性对照组明显增高，抗氧化剂预处理组可降低细胞活性氧水平且可逆转淫羊藿素的致凋亡作用， 淫羊藿素可下调 VEGF、 uPAR、 MMP2、 ADM、 Enolase-1、 aldolase A基因的表达。 结论 淫羊藿素能致骨肉瘤 Saos2 细胞凋亡可能跟细胞内活性氧的上调相关， 增殖抑制可能与 HIF1 下游基因如 VEGF、uPAR、 MMP2、 ADM、 Enolase-1、 aldolase A的表达下调有关。

淫羊藿素； Saos2 细胞； 增殖抑制； 凋亡

淫羊藿素可以致骨肉瘤 Saos2 细胞凋亡并能下调 HIF1α的表达， 凋亡的信号通常有 两条通路：由细胞内的信号变化导致细胞色素c释放入胞质及线粒体膜电位的降低激活细胞凋亡蛋白酶［1］； 一条是由细胞外死亡配体与死亡受体结合然后最 终激活 caspase家族［2］。 正 常 情况下细胞内活性氧 （ROS） 的产生和清除处于平衡的状态，以保证细胞的稳态和正常的生理活动，肿瘤细胞由于抗氧化酶低于正常细胞，所以其细胞内的活性氧处于高水平［3］， 大量学者研究表明 ROS在上述的两条凋亡通路上发挥作用［4］。 抑制肿瘤的增殖主要通过抑制肿瘤血管的新生、抑制肿瘤的糖酵解能力、抑制肿瘤的转移及免疫逃逸能力等来实现， 因为常氧下 HIF1α经过反应被泛素化降解， 所以本实验用 100μmol/L的氯化钴模拟低氧环境来研究 HIF1 的下游 基因的表 达［5］， 本实验即探究淫羊藿素在体外致肿瘤凋亡作用与细胞内 ROS 水平的关系， 增殖及转移的抑制与 HIF-1α的下游基因血管内皮生长因子 （VEGF）、 尿激酶型纤溶酶原激活剂受体 （uPAR）、 基质金属蛋白酶 2 （MMP2）、 肾上腺髓质素 （ADM）、 烯醇酶-1 （ Enolase-1） 及醛缩酶 A （ aldolase A） 表达的关系。

1 实验材料

1.1 药品与试剂 淫羊藿素 （上海源叶生物科技有限公司， 淡黄色粉末状， HPLC测定纯度 ＞98%，批号为20120207）； N-乙酰半胱氨酸、 活性氧检测试剂盒 （Sigma）； PCR试剂盒、 胎牛血清 （TRANS）；DMEM/F-12 培养基 （HyClone）； RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒 （康为世纪）。二甲基亚砜、胰蛋白酶、 Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡检测试剂盒、 琼脂糖、TAE （Solarbio）；CKK-8 细胞活力检测试剂盒 （北京庄盟国际生物基因科技有限公司）。

1.2 主要仪器 台式室温高速离心机 （上海安亭科学仪器厂）； 超低温冰箱 （Haier）； 手提式不锈钢压力蒸气灭菌器 （上海三申医疗器械有限公司）；多功能酶标仪 （BIO-RAD公司）； 冷冻高速离心机 （珠海黑马医学仪器有限公司）； CO2细胞孵箱 （SIM公司）； 超净工作台 （苏州净化设备有限公司）； PCR仪 （杭州博日科技有限公司）； 电泳仪 （美国 伯乐公司）；流式细胞仪 （BD公司）。 倒置相差显微镜（NIKON公司）；凝胶成像系统 （SIM公司）。

1.3 细胞株 人骨肉瘤细胞株 Saos2 来自本实验室库存。

2 实验方法

2.1 细胞生长及形态学观察 培养人骨肉瘤细胞株 Saos2， 分别适量接种于 24 孔细胞培养板中待细胞稳定生长良好， 两组细胞以 10 mmol/L的 N-乙酰半胱氨酸 （NAC） 预处理2 h 后分别加终浓度为20 μmol/L、50 μmol/L淫羊藿素培养基， 另两组分别直接更换终浓度为 20 μmol/L、 50 μmol/L淫羊藿素培养基， 培养 48 h后， 倒置相差显微镜下观察细胞生长及形态学变化，评价 NAC预处理过的细胞与直接加淫羊藿素细胞的生长状况的差别及形态学的不同。

2.2 细胞凋亡流式检测 利用 Annexin Ⅴ-FITC/PI双染料流式细胞分析技术检测 NAC预处理对淫羊藿素致人骨肉瘤 Saos2 细胞凋亡作用的影响， 24 孔培养板常规培养骨肉瘤 Saos2 细胞， 待其生长良好， NAC组细胞以 10 mmol/L的 NAC预处理 2 h后分别加终浓度为 20 μmol/L、50 μmol/L淫羊藿素培养基， 药物组分别直接更换终浓度为 20 μmol/L、 50 μmol/L淫羊藿素培养基， 不加任何处理的为阴性对照， 培养 48 h后， 按凋亡试剂盒操作说明进行操作，用流式细胞仪分析结果。

2.3 细胞活性氧检测 6 孔培养板常规培养骨肉瘤 Saos2 细胞， 待其生长良好， 药物组加终浓度为50 μmol/L淫羊藿素培养基分别培养 6、 12、 24 h，NAC组先用 10 mmol/LNAC预处理细胞 2 h， 再加入 50 μmol/L淫羊藿素培养 12 h， 不加任何处理的为阴性对照， 后收集细胞加含终浓度为 10 μmol/L DCFH-DA的无血清 DMEM， 在 37 ℃培养箱中避光孵育 30 min， 每 3 ～5 min 将细胞颠倒混匀一下。孵育结束后， 用冰冷的 PBS 溶液洗涤细胞 2 次，充分除去未结合的探针，上机检测。

2.4 划痕实验 种 6 孔板， 分两组： 正常组、 氯化钴 （CoCl2） 组 （100 μmol/L CoCl2+50 μmol/L淫羊藿素）， 待细胞状态良好后， 用 100 μL枪头在板上轻柔的划两条直线， 两直线距离大于 1 cm， 然后用 PBS 冲洗干净残留的细胞， 然后按分组加上不同的培养基， 然后分别在 6、 12、24 h 拍照。

2.5 RT-PCR检测 常规种板 （6 孔板） ，分 3组： 空白组 （未做 任 何 处 理组）、 氯 化 钴 组（100 μmol/L CoCl2） 、 阳 性 对 照 组 （ 100 CoCl2+50 μmol/L淫羊藿素）， 每组设 4 个复孔。 24 h按照康为世纪 RNA提取和逆转说明书进行操作， 以逆转后的 cDNA为模版扩增检测 VEGF、uPAR、 ADM、 Enolase-1、 aldolase A mRNA的 表达扩增后制胶跑电泳拍照， 用 image J软件分析灰度值。见表1。

表1 各目的基因及内参基因的引物序列Tab.1 Prim er sequences of target gene and the con trol gene

2.6 统计学处理 采用 SPSS 16.0 统计软件进行分析，数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析， 检验水准 α=0.05。

3 结 果

3.1 细胞生长及形态学观察 用以 10 mmol/L的NAC预处理2 h能明显逆转不同终浓度淫羊藿素所致的 Saos2 细胞凋亡， 细胞凋亡数目明显减低， 但和阴性对照组细胞还是存在细胞收缩变圆，并且有明显的凋亡小体存在。 见图1。

图 1 细胞形态学观察 （100 倍）Fig.1 Cellular morPhology observation（ ×100）

3.2 细胞凋亡流式检测 Annexin Ⅴ-FITC/PI双染料流式细胞分析技术：左下象限：正常存活细胞，左上象限：坏死细胞，右上象限：早期凋亡细胞，右下象限：晚期凋亡细胞。淫羊藿素作用于 Saos2 细胞及用 NAC预 处理的细胞后结果显示： 用 NAC预处理2 h可以逆转淫羊藿素致凋亡作用， 且差异具有统计学意义 （P＜0.05）， 但其凋亡率还是显著高于对照组，提示淫羊藿素致Saos2 细胞凋亡作用可能跟淫羊藿素促氧化作用有关。 见图2。

图 2 流式细胞仪检测淫羊藿素促 Soas2 细胞凋亡作用及不同状态细胞的百分比柱状图Fig.2 APoPtosis effect on Soas2 cells of icaritin

3.3 活性氧检测结果 DCFH-DA可穿过细胞膜进入细胞， 经胞内的酯酶水解作用转化生成 DCFH在活性氧作用下，DCFH被氧化成发荧光的 DCF。 细胞内 ROS的水平与 DCF的荧光强度成正比。 同对照组比较， Saos2 细胞经 50 μmol/L淫羊藿素作用后可导致荧光强度增加， 表明细胞内的 ROS在增加。 随着作用时间延长胞内 ROS水平逐渐增高并在 12 h 达到峰值， 而后 ROS 水平逐渐回落但至 24 h 胞内 DCF荧光强度仍然显著高于对照组水平。6、 12、24 h 后细胞内的平均荧光强度分别为57.5% （P＜0.05）、124.9% （P＜0.05）、 64.6%（P＜0.05）， 增多的 ROS 可以被抗氧化剂 NAC所阻断。 见图3。

3.4 划痕实验 结果显示： 阴性对照组细胞生长迅速，有明显的向远处生长转移的趋势，划痕处有明显的细胞存在，而加药组生长明显受到抑制，细胞数量比对照组明显减少，划痕处无细胞出现且细胞凋亡明显， 说明淫羊藿素有阻抑 Saos2 细胞增殖转移的作用。 见图4。

3.5 RT-PCR结果 各组处理 24 h 后结果： 与 A组相比， CoCl2组的 VEGF、 uPAR、 MMP2、 ADM、Enolase-1 表 达 水 平 均 升 高， 差 别 有 统 计 学 意 义（ P＜0.05） ， 而 aldolase A表达水 平差异 无统计学意义 （P＞0.05）； 与 CoCl2组相比， CoCl2+淫羊藿组 VEGF、 MMP2、 ADM、 Enolase-1 的表达明显降低， 差 别 均 有 统计学意义 （ P＜0.05）， 而uPAR、 aldolase A的表达与 CoCl2组相比差别无统计学意义。说明用 CoCl2模拟缺氧可以使 Saos2 高表达 VEGF、 uPAR、 MMP2、 ADM、 Enolase-1 基因，而对 aldolase A无明显影响， 而淫羊藿素可以降低在 Saos2 在缺氧环境下 VEGF、 MMP2、 ADM、 Enolase-1 基因的表达， 而对 uPAR、 aldolase A无明显影响。 见图5。

4 讨论

图 3 流式细胞仪检测淫羊藿素对细胞内 ROS水平的影响Fig.3 Effect on intracellular ROS level of icaritin

图 4 划痕实验 （100 倍）Fig.4 Scratch tests（ ×100）

活性氧主要包括超氧阴离子、羟自由基、过氧化氢等，正常情况下细胞内活性氧的产生和清除处于平衡的状态，以保证细胞的稳态和正常的生理活动［6］。 肿瘤细胞由于超氧化物歧化酶 （ SOD）、 过氧化氢酶 （CAT） 等抗氧化酶低于正常细胞， 所以其细胞内的活性氧处于高水平［7］。 降低 ROS 水平可以抑制肿瘤细胞的增殖，ROS水平增高在细胞增殖、凋亡相关的信号转导通路中也同样发挥着重要作用［8］。 有学者研究发现 ROS 致凋亡可能和 Fas受体途径相似， 因为抗氧剂可以阻抑 Fas受体途径诱导的凋亡， 并且 ROS 和 Fas受体和配体的基因表达密切相关［9-10］。 ROS 通过线粒体途径致凋亡主要是由于使线粒体 Ca2+的超载， 然后线粒体膜电位降低致线粒体膜通透性增加最终导致细胞色素c从线粒体释放入细胞质激活 Caspase家族， 另外线粒体 Ca2+的超载可以反作用使 ROS 水平升高［11］。还有学者研究发现过多的 ROS 高表达 Bcl家族的促凋亡基因 Bax是线粒体膜通透性增加从而导致细胞色素 c释放激活 Caspase家族导致凋亡［12］， 本实验中发现淫羊藿素致能使 Saos2 细胞内 ROS 量增高致细胞凋亡， 淫羊藿素的致 Saos细胞凋亡作用能被 NAC逆转， 说明淫羊藿素致 Saos细胞凋亡跟高表达其细胞内 ROS水平相关。

图 5 淫 羊 藿 素 对 Soas2 细 胞 VEGF、 uPAR、MM P2、 ADM、 Enolase-1 及 aldolase A基因表达的影响Fig.5 Effects of icaritin on VEGF， uPAR， MMP2，ADM， Enolase-1 and aldolase A exPression in Saos2

肿瘤的增殖跟诸多基因相关［13］， 如向远处转移的基因、在缺氧条件下利用营养的基因及血管新生的基因等：向远处转移主要通过分泌周围基质消化的酶如 uPAR、 MMP2 等， 从而消化周围的机制促进肿瘤细胞向远处的转移；大量研究表明肿瘤细胞利用能量主要通过糖酵解来完成，因此高表达与糖酵解相关的酶如 ADM、Enolase-1 等在肿瘤增殖过程中发挥着重要作用；血管的新生跟很多生长因子如 PDGF、 VEGF等基因相关， 此类基因可以促进血管的形成。上述各基因都受 HIF1 转录因子所调节，本实验在前期研究中发现淫羊藿素在基因水平上下调 HIF1α， HIF在转录水平上发挥作用需要低氧环境抑制 HIF1α的降解， 因为 HIF1α在常氧情况下可以被脯氨酸羟化酶羟化，羟化后被泛素化降解，因此本实验在研究与增殖抑制相关基因即HIF1 的下游基因时用氯化钴来模拟肿瘤细胞的相对缺氧环境，结果证实氯化钴组高表达了上述基因，说明缺氧环境模拟成功。本实验发现淫羊藿素可以下调细胞增殖迁移相关基因 VEGF、uPAR的表达， 且能降低 Saos2 糖酵解相关基因如 ADM、Enolase-1 的表达， 从而影响了肿瘤细胞血管的新生、降解细胞外基质、在缺氧环境下利用营养的能力，从而影响肿瘤的增殖转移的能力。

淫羊藿素致 Saos细胞凋亡跟高表达其细胞内ROS水平相关， 增殖转移的抑制作用应更进一步的分子水平的研究，用相关技术如沉默相关基因观察细胞的生物学性状的变化，进一步验证相关基因与增殖抑制的关系。

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M echanism of anti-osteosarcoma of icaritin

LIU Yu-liang1，2， YIN Chang-chang3， ZHANG Yi-ping3， LIANG Guang-sheng1，2， WEIQiang-qiang1，2，YIN Ming1*
（1.The Second Hospital Affiliated to Nanchang University， Nanchang 330006， China； 2 Graduate School of Medicine， Nanchang University， Nanchang 330006， China； 3 Analysisand Test Laboratory of Jiujiang University， Jiujiang 332000， China）

AIM To investigate the inhibitory proliferation of icaritin and its induction of apoptosis on Saos2 cells.METHODS Saos2 cells and their pretreated cellswith antioxidantwere incubated with different concentrations of icaritin， and then the change of the cellmorphologywas observed by the invertedmicroscope.Flow cytometry instrumentwas used for the detection of reactive oxygen species（ ROS） and apoptosis ratio of the cells.The scratch test for cellmigration and proliferation， under the hypoxic condition simulated by cobalt dichloride（100 μmol/L） for analog of anoxic environment of osteosarcomat， and RT-PCR for measurement of VEGF， uPAR，MMP-2， ADM， Enolase-1 and aldolase A gene expression in cells were performed.RESULTS Icaritin can increase the ROS of Saos2 as compared with the control group， antioxidant pretreatment antagonized apoptosis ratio and relative gene expression.CONCLUSION Icaritin-inducing Saos2 apoptosismay be associated with upregulation of intracellular reactive oxygen，and Icaritin's proliferation inhibition is related to down-regulation of HIF1 downstream genes such as VEGF， uPAR， MMP2， ADM， Enolase-1 and aldolase A expression.

icaritin； Saos2 cells； proliferation inhibition； apoptosis

R285.5

： A

： 1001-1528（2014）01-0004-06

,ebook=10

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.01.002

2013-05-19

刘玉亮 （1987—） ， 男， 硕士生， 研究方向： 中药抗骨肿瘤。 Tel： 18653844696， E-mail： 283401832@qq.com

*通信作者： 殷 明 （1958—）， 男， 硕士生导师， 研究方向： 端粒酶基因阻抑椎间盘退变。 Tel：（0791）86298917