一种从大肠杆菌包涵体中分离纯化GST-TRAF6融合蛋白的方法

张西轩 李晔 张振奇 董世瑞 赵培 阮海华

（天津商业大学 天津市食品生物技术重点实验室 生物技术与食品科学学院，天津 300134）

一种从大肠杆菌包涵体中分离纯化GST-TRAF6融合蛋白的方法

张西轩 李晔 张振奇 董世瑞 赵培 阮海华

（天津商业大学 天津市食品生物技术重点实验室 生物技术与食品科学学院，天津 300134）

利用8 mol/L尿素溶液对表达在大肠杆菌包涵体中的GST-TRAF6融合蛋白进行变性，通过逐级稀释复性的方法对尿素溶解后的GST-TRAF6融合蛋白进行复性，将复性后的GST-TRAF6融合蛋白进一步利用谷胱甘肽琼脂糖树脂亲和层析的方法进行分离纯化，将分离纯化后的蛋白通过Western blot方法进行验证，最后利用体外泛素化反应检测经包涵体变性、复性和纯化后的GST-TRAF6融合蛋白的生物学活性。经过包涵体变性、梯度稀释复性和谷胱甘肽琼脂糖树脂亲和层析3个步骤后纯化得到纯度达90%以上、浓度为396 ng/μL的蛋白质溶液。利用GST蛋白作为对照，经Western blot验证表明，纯化得到的蛋白确为GSTTRAF6融合蛋白。进一步利用体外泛素化反应分析其泛素连接酶活性发现，17 ng/μL浓度的GST-TRAF6融合蛋白能够以泛素分子作为底物在5 min内快速催化自由泛素链的生成。结果表明，表达在大肠杆菌包涵体中的GST-TRAF6融合蛋白经尿素变性溶解后能够成功复性并分离纯化，在溶解性改变的同时恢复了其泛素连接酶活性。为从大肠杆菌包涵体中大规模分离纯化蛋白质提供了一种新的复性方法。

TRAF6 蛋白纯化 包涵体复性 重组蛋白

肿瘤坏死因子受体相关因子（Tumornecrosis factor receptor-associated factors，TRAFs）是肿瘤坏死因子（Tumornecrosis factor，TNF）超家族和 Toll 样/白细胞介素-1受体（toll/IL-1 receptor，TIR）超家族重要的接头分子，在天然免疫和获得性免疫中发挥重要作用［1，2］。TRAFs 包括7个密切相关的蛋白（TRAF1-7），其中TRAF6 是脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）、TIR 和 TNF（Tumor necrosis factor）等刺激信号的下游分子［3-5］。TRAF6含有C端TRAF结构域和 N 端激活结构域，可以和多种激酶结合［6］。其中，其N端激活结构域包括一个 RING 型泛素连接酶（ubiquitin ligase enzyme，E3）结构域，该结构域具有泛素连接酶活性，可在泛素结合酶（ubiquitinconjugating enzyme，E2）UbcH5c 的介导下催化自由泛素分子形成多聚泛素链［7，8］。研究表明，TRAF6与炎症、骨代谢、乳腺发育、淋巴结的形成密切相关，参与免疫性疾病、骨髓瘤、急性胰腺炎、前列腺癌等疾病的病理机制，在细胞的生长、发育以及疾病过程中发挥重要的作用［9］。孙利等［10］在大肠杆菌中诱导了GST-TRAF6融合蛋白的表达，并利用谷胱甘肽琼脂糖树脂纯化到了该融合蛋白。但是，大肠杆菌中表达的GST-TRAF6融合蛋白只有少部分重组蛋白是可溶的，大部分的重组蛋白在大肠杆菌表达过程中主要以包涵体的形式存在。较低的蛋白可溶性降低了GST-TRAF6融合蛋白的纯化效率以及重组蛋白的纯化总量，因此，在孙利等［10］的研究成果基础上，本研究运用了一种从包涵体中复性并分离纯化GST-TRAF6融合蛋白的方法，以期获得更高产量更高纯度的GST-TRAF6融合蛋白，降低纯化成本，并为今后进一步研究 TRAF6 蛋白的结构与功能打下坚实的基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与质粒E.coliDH5α、E.coliBL21（DE3）感受态细胞购自美国Promega公司；pGEX-6P-2原核表达载体购自GE Healthcare 公司。

1.1.2 酶与试剂 辣根过氧化物酶（HRP）偶联羊抗小鼠二抗、辣根过氧化物酶（HRP）偶联羊抗兔二抗、γ-ATP 购自美国Promega公司；兔源TRAF6 抗体（α-TRAF6 Cat：sc-7221）、鼠源泛素抗体（α-Ub，Cat：sc-8017）购自美国 Santa Cruz公司；HeLa细胞 cDNA文库（Cat：YJ0001）购自上海英基生物科技有限公司；琼脂糖、尿素、DTT、Triton X-100、IPTG、PMSF购自美国Amresco公司；BglⅡ、BamHⅠ和XhoⅠ限制性内切酶、T4 DNA连接酶、PfuDNA聚合酶、dNTP、DNA Marker购自日本TaKaRa公司；PCR及酶切产物纯化试剂盒、质粒 DNA 提取试剂盒购自中国北京天根公司；预染蛋白Marker购自美国 Thermo 公司；超滤浓缩管、泛素激活酶E1（Cat：14-857）、UbcH5c（Cat：23-035）、ECL 化学发光试剂盒购自美国Millipore公司；X光片购自美国Kodak公司；Ubiquitin蛋白由西南大学李洪涛教授提供；引物合成以及测序由上海英骏生物技术有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 TRAF6基因的克隆与原核表达载体的构建以HeLa细胞cDNA文库为模板，上游引物序列为5'-CGAGATCTATGAGTCTGCTAAACTGTGAAAAC-3'（下划线为BglⅡ酶切位点），下游引物序列为5'-GCCTCGAGCTATACCCCTGCATCAGTAC-3'（下划线为XhoⅠ酶切位点），以58℃作为退火温度进行 PCR扩增，将 PCR 产物回收后分别用BglⅡ和XhoⅠ双酶切并回收产物。同时利用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切pGEX-6p-2空载体，回收并将其与酶切后的TRAF6片段进行连接。将连接产物转入DH5α大肠杆菌感受态细胞，在氨苄青霉素抗性平板上挑取单克隆并抽提质粒。其中，由于TRAF6基因片段上第31-36位碱基间为BamHⅠ位点，因此在设计TRAF6上游引物时选择了BamHⅠ的同尾酶BglⅡ作为酶切位点，而对候选阳性重组质粒的酶切鉴定采用BamHⅠ和XhoⅠ两个酶切位点，将阳性pGEX-6P-2-TRAF6重组质粒送上海英骏生物技术有限公司进行 DNA 测序。测序正确的阳性克隆用于之后的质粒转化和蛋白的诱导表达。

1.2.2 TRAF6在大肠杆菌中的诱导表达 将 pGEX-6P-2-TRAF6 重组质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3），挑取单克隆至5 mL LB（含 100 μg/mL氨苄青霉素）液体培养基中，并于37℃、220 r/min 振荡培养过夜。将过夜培养物接入 1 L LB（含100 μg/mL氨苄青霉素）液体培养基中，并于37℃、220 r/min 振荡培养至OD600=0.6-0.8之间。将培养物降温至20℃左右后加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG，20℃、220 r/min振荡培养过夜；收集菌液，室温下8 000 r/min 离心30 min；弃上清，保留沉淀；取10 μL离心后菌体用90 μL无菌水重悬，加入100 μL 2×SDS上样缓冲液混匀，煮沸5-10 min 后离心，进行 SDS-PAGE，观察全菌蛋白的表达情况；以未经IPTG诱导的菌为阴性对照。

1.2.3 包涵体蛋白的变性、复性与纯化 将上述收集的菌体利用50 mmol/L Tris-HCl pH8.0 内含 150 mmol/L NaCl、1 mmol/L PMSF 的缓冲溶液于冰上进行超声破碎，超声3 s、间隔7 s，超声约100次至悬液半透明；于14 000 r/min转速下低温离心30 min，将离心后的上清弃掉，用破碎缓冲重悬沉淀并将悬液再次于14 000 r/min转速下低温离心30 min，沉淀即为包涵体部分。为了去除包涵体中的部分杂蛋白，首先对包涵体进行洗涤，洗涤液的组成为50 mmol/L Tris-HCl pH8.0，内含 2 mol/L尿素、1 mmol/L EDTA、0.5% Triton X-100、0.1 mol/L NaCl 以及10 mmol/L DTT，14 000 r/min 转速下低温离心10 min，离心后收集沉淀。将洗涤后的包涵体利用变性液（50 mmol/L Tris-HCl pH8.0，含 8 mol/L尿素、20 mmol/L DTT）进行变性溶解；将溶解后的包涵体溶液利用复性液（50 mmol/L Tris-HCl pH8.0，含0.5 mmol/L EDTA、50 mmol/L NaCl、5% glycerol、1 mmol/L DTT）按照2倍的梯度进行稀释复性，直至稀释到尿素终浓度达到0.5 mol/L；最后利用截留分子量为3 kD的超滤浓缩管浓缩复性后的溶液。浓缩后的复性溶液与适量的谷胱甘肽琼脂糖树脂匀浆混合，4℃轻摇30 min；于500 r/min 离心5 min后弃上清；沉淀加入10倍柱床体积的漂洗液，即50 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）溶液反复颠倒混匀以洗去未与谷胱甘肽琼脂糖树脂结合的杂蛋白，4℃、500 r/min离心5 min 后弃上清，继续用漂洗液重复洗涤谷胱甘肽琼脂糖树脂3次；加入等柱床体积的洗脱缓冲液（50 mmol/L Tris-HCl pH8.0，内含10 mmol/L GSH）重悬树脂，室温孵育10 min后于500 r/min 离心5 min，保留上清；再用等体积的洗脱缓冲液洗脱并离心后合并2次所得上清，即为纯化得到的GST-TRAF6融合蛋白；取100 μL该蛋白溶液与等体积2×SDS上样缓冲液混匀，煮沸 5-10 min后离心，进行SDSPAGE，观察蛋白纯化情况。

1.2.4 GST-TRAF6融合蛋白的Western blot检测 将纯化得到的GST-TRAF6融合蛋白样品稀释至终浓度为10 ng/μL，取20 μL稀释后的蛋白与等体积2×SDS上样缓冲液混匀，煮沸 5-10 min后离心，进行SDSPAGE电泳后利用半干法转印至PVDF膜，转印条件为23 V 1 h；将转印后的PVDF膜于5%的脱脂奶粉中封闭1 h，将兔源TRAF6抗体按照1∶1 000的比例稀释后于4℃下孵育PVDF膜过夜；次日，TBST溶液润洗PVDF膜3次，每次15 min；将润洗干净的PVDF膜于室温下用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG二抗（稀释比例1∶5 000）孵育 1 h，TBST溶液分别润洗3次后进行ECL化学发光检测，并用X光片压片。

1.2.5 GST-TRAF6 融合蛋白泛素连接酶活性检测 泛素连接酶活性测定采用Yang等［7］的方法，30 μL反应体系包含50 mmol/L Tris-HCl（pH7.4），2.5 mmol/L MgCl2，50 ng泛素激活酶 E1，300 ng泛素结合酶UbcH5c，500 ng GST-TRAF6，1 μg泛素，最后加入终浓度为 2 mmol/L的γ-ATP启动泛素化反应。反应温度是37℃，至5、10和20 min时分别从反应体系中吸取10 μL反应液并迅速加入10 μL 2×SDS载样缓冲终止反应，煮沸5-10 min后离心，利用12.5% SDS-PAGE进行电泳分离，Western blot方法同1.2.4，一抗为鼠源泛素抗体（稀释倍数1∶1 000），二抗为辣根过氧化物酶偶联羊抗小鼠IgG（稀释倍数1∶5 000）。

2 结果

2.1 TRAF6 基因的扩增

TRAF6 是一个包括522个氨基酸的具有泛素连接酶活性的蛋白质。利用TRAF6基因特异性引物从HeLa细胞 cDNA文库中以58℃作为退火温度扩增TRAF6基因片段，PCR 扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，在预期的位置（1 569 bp）上出现一条特异带（图1）。

2.2 pGEX-6P-2-TRAF6 重组克隆质粒的构建

以限制性核酸内切酶BamHⅠ和XhoⅠ对重组质粒进行双酶切后得到一条与预期条带大小一致的DNA 片段（1 533 bp）（图2），表明pGEX-6P-2载体上成功插入了TRAF6目标基因片段，初步推断质粒构建成功。经DNA测序鉴定后挑取测序正确的阳性pGEX-6P-2-TRAF6质粒转化至大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）中。

2.3 GST-TRAF6融合蛋白的诱导表达以及可溶性检测

在20℃温度条件下利用IPTG诱导重组菌表达后发现与未诱导的大肠杆菌相比，0.5 mmol/L IPTG处理诱导了一条分子量介于72-96 kD间的蛋白质的表达，该诱导蛋白的分子量与预期的GST-TRAF6融合蛋白的分子量（26 kD+62 kD）相近（图3泳道1和泳道2）。据此推测，利用0.5 mmol/L IPTG成功诱导了GST-TRAF6融合蛋白在大肠杆菌中的表达。将大肠杆菌进行超声破碎后，分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色、脱色后发现在上清和沉淀中均含有表达的GST-TRAF6融合蛋白（图3泳道3和泳道4），但是通过比较上清和沉淀样品中GST-TRAF6融合蛋白的条带粗细情况可以看出，上清液中GST-TRAF6融合蛋白的含量远远低于包涵体中GST-TRAF6融合蛋白的含量，大部分的GST-TRAF6 融合蛋白在沉淀中以包涵体的形式存在（图3泳道4），仅有少量的蛋白可溶性地存在于离心后的上清溶液中（图3泳道3）。

2.4 包涵体中GST-TRAF6融合蛋白的变性、复性与纯化

通过对大肠杆菌包涵体利用洗涤液洗涤后进行SDS-PAGE 电泳（图4泳道1）检测发现，GSTTRAF6融合蛋白含量约占包涵体中总蛋白含量的75%以上。将溶解后的包涵体溶液利用复性液以2倍的梯度进行缓慢稀释复性，稀释的过程中肉眼可以观察到没有蛋白质沉淀析出，当该蛋白溶液被复性液稀释至尿素终浓度为0.5 mol/L（相当于稀释16倍）的浓度时，GST-TRAF6融合蛋白仍然保持可溶。将复性后的溶液进一步利用截留分子量为3 kD的超滤浓缩管浓缩10倍后进行SDS-PAGE电泳检测，结果（图4泳道2）显示，虽然有部分 GST-TRAF6融合蛋白发生降解，但是仍有大量结构完整的GSTTRAF6融合蛋白。

将浓缩后的GST-TRAF6融合蛋白利用谷胱甘肽琼脂糖树脂进行亲和层析纯化，润洗去除杂蛋白后最终用10 mmol/L还原型谷胱甘肽溶液进行目标蛋白的洗脱，将洗脱后的蛋白进行SDS-PAGE电泳检测，结果（图4泳道3）显示，成功纯化到了预期的目标蛋白，仅有一条微弱的杂带存在，纯化蛋白纯度达到90%以上。表明利用亲和层析法成功纯化得到目标蛋白，通过对纯化蛋白的浓度进行测定后发现，纯化得到的目标蛋白的浓度达到396 ng/μL。

2.5 GST-TRAF6融合蛋白的Western blot检测

为了进一步验证纯化的蛋白确为GST-TRAF6融合蛋白，将纯化得到的蛋白稀释至 10 ng/μL后，取5 μL进行Western blot 分析，同时利用等量的GST蛋白作为对照。结果（图 5）显示，利用GST抗体作为一抗成功地将作为对照的GST蛋白以及纯化的目标蛋白检测出来，表明本研究中纯化的蛋白确为目标GST-TRAF6融合蛋白。

2.6 GST-TRAF6融合蛋白泛素连接酶活性检测

为了验证包涵体中的GST-TRAF6融合蛋白经过变性、复性步骤后是否具有与天然蛋白一致的酶催化活性，本研究通过体外泛素化反应检测GSTTRAF6融合蛋白的泛素连接酶活性。泛素化反应结果（图6）显示，与0 min未发生反应的泛素底物（Ub1）相比，体外泛素化反应进行 5、10及20 min时均催化了自由泛素链的生成，包括泛素二聚体（Ub2）、泛素三聚体（Ub3）、泛素四聚体（Ub4）以及泛素多聚体（Ubn）。而且从图6中可以看出，泛素化反应进行5、10及20 min时自由泛素链的生成情况基本一致，表明17 ng/μL浓度的 GST-TRAF6融合蛋白在5 min内即迅速完成了自由泛素链的生成。

3 讨论

孙利等［10］曾利用pGEX-4T-2质粒作为表达载体在大肠杆菌中表达GST-TRAF6融合蛋白，将大肠杆菌超声破碎后在可溶性上清中纯化该融合蛋白。与本研究的结果相类似，孙利等［10］的研究结果表明在大肠杆菌中表达的GST-TRAF6融合蛋白只有少部分以可溶的形式存在，大部分的融合蛋白以不溶的形式存在于破菌后的沉淀即包涵体中。基于此，本试验在该研究的基础上，利用pGEX-6P-2作为表达载体在大肠杆菌中表达，并在大肠杆菌包涵体中分离纯化GST-TRAF6融合蛋白的方法。

众所周知，在大肠杆菌中表达重组蛋白的过程中由于缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子或环境不适，无法形成正确的次级键等原因容易导致包涵体的形成［11］。虽然凝集在包涵体中的蛋白没有活性，但是在包涵体中表达的蛋白占总蛋白的50%以上，如果能成功对表达的目标蛋白进行溶解和复性将大大提高纯化蛋白的总量以及纯度，并减少了细菌的蛋白酶对目标蛋白的降解作用。本研究结果表明，利用尿素变性、梯度稀释复性结合谷胱甘肽琼脂糖树脂亲和层析3个步骤在大肠杆菌包涵体中成功地纯化到浓度达到396 ng/μL、纯度超过90%、具有高泛素连接酶活性的GST-TRAF6融合蛋白。包涵体表达的GST-TRAF6融合蛋白分离纯化成功的关键是高浓度尿素溶解后包涵体蛋白的复性。在以往的研究中，包涵体蛋白复性的手段主要包括：（1）氧化-还原转换系统的加入，例如在复性缓冲液中需加入还原型及氧化型谷胱甘肽、半胱氨酸、半胱胺等给复性蛋白质提供一个氧化还原环境，促进二硫键的正确行成；（2）聚乙二醇能够减少一些蛋白质的聚集；（3）分子伴侣和折叠酶等可在体外促进蛋白质的折叠复性等［12］；（4）柱层析法对包涵体蛋白进行复性［13］。与以往报道的蛋白质复性技术相比较，本研究报道的GST-TRAF6融合蛋白成功复性的创新之处主要包括两点：其一是复性液的构成。本研究中的复性液除了最适宜蛋白质复性的pH8.0外，还含有5%的甘油，一定浓度甘油的加入在一定程度上改变了溶液的极性和渗透压有利于GST-TRAF6的复性。同时复性液中含有少量的DTT，改变溶液的氧化还原系统进而提高了正确配对的二硫键的产率，利用该复性液我们曾经成功复性过酿酒酵母PTC6蛋白［14］。其二是复性的过程采用的是梯度逐级稀释的方法，该稀释方法为蛋白质的复性提供了缓慢变化的蛋白质溶液外环境以及更充分的复性时间。当我们利用复性液作为透析液对尿素溶解后的包涵体溶液直接进行透析复性时发现，可能由于尿素去除的速度太快导致大量的蛋白从溶液中析出，出现絮状沉淀（结果未列），表明缓慢稀释复性对于GST-TRAF6融合蛋白的复性是更具可行性的方法。

由于泛素连接酶的酶活性检测均为基于Western blot的方法，无法测定其活力与比活力。为此，分析了前人在研究中利用TRAF6蛋白催化体外泛素化反应的浓度。Zhang等［15］发现，在20 μL的泛素化反应体系中加入了0.3 μg TRAF6蛋白进行泛素化反应，该浓度相当于15 ng/μL，与本研究中的17 ng/μL的TRAF6蛋白浓度相近。Xia等［16］进行TRAF6催化的自由泛素链生成的体外反应中，TRAF6蛋白的浓度为0.4 μmol/L，而本研究中17 ng/μL的TRAF6蛋白的浓度经过换算后摩尔浓度为0.2 μmol/L，即相当于Xia等［16］的体外泛素化反应体系中TRAF6蛋白浓度的一半。以上结果表明，包涵体表达的GSTTRAF6蛋白经变性、复性恢复了较高的生物学活性。

从包涵体中纯化蛋白是生物制药领域常用的而且成本较低的纯化手段［17］，本研究在获得成功复性的 GST-TRAF6 融合蛋白的基础上，同时提供了一种能够广泛用于包涵体蛋白分离纯化的复性技术和手段，为大规模低成本纯化蛋白提供了一种新的手段和方法。

4 结论

本研究利用8 mol/L 尿素溶液变性、梯度稀释复性和谷胱甘肽琼脂糖亲和层析3个步骤从大肠杆菌包涵体中成功分离纯化得到纯度达90%以上、浓度为396 ng/μL的GST-TRAF6蛋白质溶液。进一步利用体外泛素化反应分析其活性发现，17 ng/μL浓度的GST-TRAF6蛋白能够以泛素分子为底物在5 min内快速催化自由泛素链的生成，达到文献中所报道的TRAF6的酶催化活性水平，为从大肠杆菌包涵体中大规模分离纯化蛋白质提供了一种新的复性方法。

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（责任编辑 马鑫）

Purification of GST-TRAF6 Fusion Proteins from Inculsion Body Expressed in E. coli

Zhang Xixuan Li Ye Zhang Zhenqi Dong Shirui Zhao Pei Ruan Haihua
（Tianjin Key Laboratory of Food Science＆Biotechnology，College of Biotechnology＆Food Science，Tianjin University of Commerce，Tianjin 300134）

There was only a minor fraction of GST-TRAF6 fusion proteins were observed soluble when expressed inE.coli. Most of the GST-TRAF6 fusion proteins were present in the inclusion body, in which the expressed proteins aggregate and exist in inactive. To obtain GST-TRAF6 fusion protein in a high yield and high purity, a method to purify the GST-TRAF6 fusion proteins from inclusion body without any loss of its bioactivity was constructed. Firstly, the inclusion body was denatured with 8 mol/L urea. Secondly, the GST-TRAF6 fusion protein in inclusion body were gradually solubilized by gradient dilution renaturation. Once the GST-TRAF6 fusion protein was fully dissolved in renaturation solution, it was conventional to purify the GST-TRAF6 fusion protein with glutathione sepharose 4B. The specificity and the bioactivity of the purified GST-TRAF6 fusion protein were testified by western blot andin vitroubiquitination assay, respectively. The results indicated that GST-TRAF6 fusion protein were successfully solubilized by gradient dilution renaturation following the denaturation of 8 mol/L urea, the concentration of the purified GST-TRAF6 fusion protein was achieved a concentration of 396 ng/μL with a purity over 90%. The specificity of this GST-TRAF6 fusion proteins were identified with anti-GST western blot.In vitroubiquitination assay indicated that the GSTTRAF6 fusion protein in a concentration of 17 ng/μL could rapidly catalyze the formation of free ubiquitin chains within 5 minutes. In conclusion, it was found that the GST-TRAF6 fusion protein could be successfully renatured with the method of gradient dilution renaturation with the recovery of its capability of ubiquitin ligase. This results would supply a useful method for the large-scale purification of proteins from inclusion body when expressed inE. coli.

TRAF6 Protein purification Inclusion body renaturation Recombinant protein

2014-01-23

国家自然科学基金项目（81101220），天津市应用基础与前沿研究计划项目（12JCQNJC08100），“十二五”天津市中青年骨干创新人才支持计划，天津市教委高等学校科技发展基金计划项目（20130624）

张西轩，男，硕士研究生，研究方向：病原微生物与基因工程；E-mail：xixuanzhang@163.com

阮海华，博士，副教授，研究方向：病原微生物与基因工程；E-mail：ruanhaihua@tjcu.edu.cn