TAP亲和标签选择及其在植物蛋白互作研究中的应用

张志飞 赵志丽 文昭竹

（湖南农业大学草业科学研究所，长沙 410128）

TAP亲和标签选择及其在植物蛋白互作研究中的应用

张志飞 赵志丽 文昭竹

（湖南农业大学草业科学研究所，长沙 410128）

串联亲和纯化法（TAP）是一种纯化生理条件下蛋白复合物的技术，已广泛应用于鉴定蛋白相互作用和揭示蛋白复合物互作网络。近年来，随着TAP新型标签的不断出现以及与其他技术的联用，TAP技术正逐渐应用于植物蛋白质互作研究中。综述了TAP亲和标签选择，并介绍其在植物蛋白互作研究中的成功应用。

串联亲和纯化 亲和标签 植物 蛋白质相互作用

生物体通过各种蛋白互作（Protein-protein interactions，PPIs）来传递信息，PPIs是生物体每个细胞生命活动的基础和特征［1，2］，研究PPIs有助于揭示在分子水平上蛋白质的未知功能以及深入了解复杂的蛋白互作网络。该研究已成为蛋白组学研究的重要内容之一，也是蛋白质功能分析研究领域的热点。目前已建立多种研究方法用于探索PPIs，包括串联亲和纯化法（Tandem affinity purification，TAP）、免疫共沉淀法（Immunoprecipitation，IP）、酵母双杂交（Yeast Two-Hybrid，Y2Z）、噬菌体展示（Phage display）、亲和印迹（Affinity blotting）、表面等离子共振技术（Surface plasmon resonance technology，SPR）和蛋白质芯片（Protein array）等［1-5］。随着超灵敏和高通量的质谱（Mass spectrometry，MS）技术的出现，蛋白复合物的原位亲和纯化方法逐渐得到应用，特别是基于融合亲和标签（Affinity tag）诱饵蛋白表达的TAP技术。

1999年，TAP蛋白质复合物纯化技术最早应用于酵母细胞中蛋白质复合物的纯化［6］。目前，由TAP技术产生的PPIs实验数据正在不断填充或更新蛋白质生物信息学数据库，TAP与MS组合分析已成为鉴定蛋白质复合物和解析其作用特性的一个标准方法，也常用于蛋白质组装的系统研究［7，8］。TAP兼有标准亲和纯化和免疫共沉淀两种生化方法的优点［9，10］，已成功应用于各种细胞和生物体［11-15］。研究证明TAP灵敏度较高、错误率低，其主要特点表现为［8，11，16］：TAP 确保高度特异性的蛋白复合物分离，非特异蛋白量很低，有助于简化后续共纯化蛋白的鉴定和验证；两步洗脱纯化法允许蛋白质复合物在温和条件洗脱，不需要强烈冲洗。因此，可

更好地保持蛋白复合物的自然修饰和结合状态，有利于保持蛋白质成分的天然构象和蛋白复合物的完整性及下游的蛋白组成和功能分析。利用TAP技术大规模分析不同物种（如酵母和哺乳动物细胞等）PPIs的报道很多，但植物蛋白质复合物纯化的报道相对较少。本文重点阐述TAP亲和标签的选择、与其他技术联用及其在植物PPIs研究中的应用。

1 TAP的原理

TAP从内源性蛋白中分离纯化蛋白复合物，借助MS技术研究PPIs。TAP标签融合蛋白的设计和创建步骤包括亲和标签的选择、标签的相对顺序和纯化方式等。经典TAP标签由3部分组成：金黄色葡萄球菌Protein A（蛋白A的IgG结合域）、烟草蚀纹病毒蛋白酶（Tobacco etch virus，TEV）可剪切序列和钙调蛋白结合肽（Calmodulin-binding peptide，CBP）［17］。TAP技术通过两个连续的亲和纯化步骤来减少非特异性蛋白的结合［8，15］（图 1）。先将靶蛋白和TAP标签（Protein A 和CBP）融合表达为标签靶蛋白（CBP 端与靶蛋白相连），在温和条件下标签靶蛋白与内源蛋白质互作形成蛋白复合物。然后TAP标签蛋白复合物通过第1个标签Protein A 特异性结合到IgG 琼脂珠，并涤除大部分污染物，再用TEV 蛋白酶切割蛋白复合物的标签识别位点，以释放结合的蛋白复合物。随后该蛋白复合物通过第2个标签 CBP结合到钙调蛋白琼脂珠（Calmodulin beads），经进一步洗涤，用EGTA（乙二胺四乙酸）钙螯合剂溶出钙调蛋白琼脂珠结合的蛋白复合物。最后分离纯化的蛋白通过串联质谱（Tandem MS）、双向电泳（2D-PAGE）或免疫杂交等方法鉴定分析。

2 TAP亲和标签的选择

各种TAP标签性质和纯化介质各异，应根据自身研究对象选择和设计合适的TAP标签。早期TAP技术采用基于Protein A的亲和标签，这允许融合蛋白通过IgG的亲和层析进行一步法纯化［16］。此后，逐渐开发出利用不同亲和作用模式的各种TAP标签，相应的亲和纯化方法已被证明是有效的捕获重组蛋白的方法。其中，短肽标签（Flag、HA、Myc和V5等）有效地降低了TAP 标签在与目的蛋白连接时对靶蛋白结构和功能的干扰的可能性，可以被其特异性抗体识别。而大片段TAP标签（如GST和MBP等）可扮演双重角色：除了作为亲和标签外，标签与诱饵蛋白融合，增强的表达蛋白的溶解性和/或促进标签融合蛋白质的正确折叠。根据亲和标签的特异性，溶解度和结合/洗脱的条件会有不同。此外，不同标签的纯化效率及相关成本差异显著［18，19］。很多研究指出，没有完全满意的通用理想标签，特定标签的好坏取决于实际应用效果。当为某个特定蛋白互作研究项目选择亲和标签时，目标蛋白特性（如稳定性和溶解性）、生产规模和所需纯度是首要考虑的主要因素［16］。所以通常情况下，标签选择依赖于TAP纯化蛋白复合物的研究经验。

截止目前，关于通过TAP技术从植物中纯化蛋白复合物的报道数量有限，一些已用于植物PPIs研究的亲和标签，见表1。植物TAP标签经常采用经典的酵母TAP标签或其对应的植物改良TAP标签（Improved TAP tag，TAPi）［13］。后者以经典的酵母TAP标签为基础，加入植物优化的密码子序列和基因高表达的内含子，没有隐秘性核定位信号（Nuclear localization signals，NLS）。经典酵母TAP标签和改良TAP标签已成功应用于拟南芥［20-22］和水稻［23］的蛋白质复合物纯化。研究发现［24］，替代的TAP标签（Alternative TAP tag，TAPa）可以纯化拟南芥的蛋白复合物，TAPa 的CBP域被9 × Myc和6 × His序列替换，从而防止内源性钙调蛋白结合蛋白的非特异性纯化，并允许阳离子依赖型酶（Cationdependent enzyme）复合物的纯化。Rubio等［24］用TAPa 与拟南芥CSN3（COP9 Signalosome complex subunit 3）融合表达，纯化出多亚基蛋白COP9复合体，而 TEV切割位点被替换成特异性更强，并具有低温活性的人鼻病毒3C蛋白酶（Human rhinovirus 3C protease，HRV 3C Protease）切割位点。TAPa标签仅能纯化单个蛋白质复合物，常被用在蛋白质凝胶印迹和免疫共沉淀或染色质免疫沉淀实验中［24］。

引入TAP标签会影响靶蛋白与亲和配基的结合，从而影响蛋白质的表达，干扰靶蛋白的结构和功能，给标签融合蛋白的鉴定带来一定的困难。TAP标签细胞内源蛋白与TAP标签的CBP结合影响第2次亲和纯化效率；纯化试剂影响蛋白复合物的完整性和活性。通过选择合适的标签、调整标签的位置和研发标签纯化新方法等使TAP技术不断完善。TAP标签已被成功地应用于纯化拟南芥抗病性［29］、细胞周期［20］、线粒体生物合成［30］、盐胁迫耐受性［31］、核质运输［21］、胚胎发育［32］、蛋白磷酸酶抑制因子［33］和水稻蛋白激酶［34］和开花基因［23］的相关PPIs。近几年陆续有新的标签组合和方法应用于植物PPIs研究。Zenser等［28］利用Flag和HA亲和标签组合到诱饵蛋白的新TAP系统，成功验证植物蛋白质复合物的分离。这个系统的主要优点是：Flag-HA短肽标签减少了蛋白质功能的干扰；标签与抗体亲和组合的高特异性适用于各种植物物种；不使用蛋白酶消化，也不需要EGTA作螯合剂，兼容质谱的洗脱条件。Stoppel等［26］通过质体核糖核酸酶（RNase E，RNE）在拟南芥RNE突变体与TAP标签3 × HA或Strep-tag III蛋白融合表达，并与质谱联用成功发现维管植物特有的调控互作蛋白RHON1（光合自养生长的关键因子），RHON1与RNE形成独特的蛋白复合体（800 kD）。Jeong等［27］通过TAP标签ProtACBP或FSG（3 × Flag-Strep-Protein G）与CPL1（Carboxyl-terminal domain phosphatase-like 1）融合表达，在拟南芥悬浮培养细胞中纯化出RCF3（Regulator of Cbf Gene Expression 3），而且先后被酵母双杂交、荧光素酶互补成像和双分子荧光互补分析证实了CPL1和RCF3在体内强烈互作。

3 TAP与其他技术的联用

TAP 技术适用于生理条件下PPIs的分离及蛋白质复合物活性检测。但与其他生物体相比，TAP技术在植物PPIs的应用上存在一定局限性。与酵母不同，高等植物的高效同源重组是不可行的，内源性蛋白质会在一定程度上干扰 TAP标签融合蛋白与其互作蛋白的结合，从而降低了融合蛋白与其互作蛋白的结合效率，导致提取率降低。因此，内源性蛋白会在复杂的装配中与其对应的TAP标签融合蛋白竞争。为了尽量避免此缺陷，TAP标签蛋白可以引入植物突变体，该突变体通过RNA干扰（RNA interference）抑制或转移DNA（T-DNA）插入消除内源基因［1，3］。TAP与这些技术联用能为标签蛋白提供更多可利用的互作蛋白，增加纯化的成功率，从而更准确地鉴定标签蛋白质的功能。此外，过表达标签诱饵蛋白增强与内源性蛋白结合的竞争力，也是植物TAP成功报道的常用方法［16，17］。但标签诱饵蛋白的过量表达经常会导致蛋白的非特异性变化或者蛋白与非自然蛋白的互作。所以最好使用目的蛋白的自有启动子来控制其在宿主细胞中的表达。

该技术与大多数研究PPIs的技术一样，存在假阳性的问题，需要在实验中仔细验证，尤其在低丰度蛋白复合物和瞬时或微弱的PPIs研究中容易出现。核苷酸可通过PCR扩增控制量的变化，使其量与细胞蛋白质量一致，保持在10-100拷贝至107拷贝的动态变化中，TAP纯化成功率依赖于蛋白质复合物的量和MS的灵敏度。多个洗脱组合或者增加植物性样品的起始蛋白量可以减少假阳性干扰［1，16］。另外，与整株植物相比，植物细胞悬浮液可以快速增长，并提供无限量供应的同步生物材料，这意味着提供更多的蛋白质给复杂的蛋白或复合物装配，可以提高植物样品的起始蛋白量，并广泛用于参与初级代谢、基因表达或细胞壁合成等生物过程的植物蛋白复合物分离。低丰度蛋白质（如膜蛋白等）形成的靶蛋白复合物量较少，有时很难通过TAP技术检测。膜相关的抗病性蛋白（Membrane-associated disease resistance protein）RPS2是质膜低丰度蛋白，利用TAP与交联试剂DSP（Dithiobis succinimidyl propionate）联用纯化RPS2的PPIs时发现，与交联试剂联用纯化获得的RPS2相互作用蛋白RIN4比单独使用TAP获得的量更大，而且交联试剂在纯化过程中使蛋白复合物更加稳定，此法可用于纯化膜蛋白的相互作用蛋白或瞬时结合蛋白［35，36］。

新亲和标签的出现和质谱等技术联用的快速发展，植物TAP将不断的快速“更新升级”，从而推动植物生物大分子复合体结构及蛋白质相互作用的深入研究。理想的蛋白质相互作用研究方法应该能够具有高特异性，高度真实性和高分辨率等特点，目前仅依靠单一研究方法很难实现。今后TAP会与各种方法技术并存，相互间交叉互补联用，将成为研究植物蛋白质相互作用的主要技术手段。

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（责任编辑 狄艳红）

Tag Selection of Tandem Affinity Purification and Its Application in Plant Protein-Protein Interactions

Zhang Zhifei Zhao Zhili Wen Zhaozhu
（Grassland Science Institute，Hunan Agricultural University，Changsha 410128）

Tandem affinity purification（TAP）is a technology for the purification of protein complex under the normal physiological conditions, which has been extensively utilized to identify protein-protein interactions（PPIs）and reveal interaction network of protein complexes. In recent years, TAP technology has been improving in the PPIs study, with the development of new labels, TAP method improvements and jointed use with other technologies associated. TAP technology is also being increasingly used in the studies of plant PPIs. This paper reviews the selection of TAP affinity tag and advance of research that TAP has been successful used in the study of plant PPIs.

Tandem affinity purification Tag Plant Protein-protein interactions

2014-01-03

张志飞，女，博士，副教授，研究方向：牧草及草坪草抗性分子生物学；E-mail：zzf0917@ aliyun.com