重组肌红蛋白的原核表达、纯化及其冻干质控品的制备

任艳娜 才蕾 武建伟 钱伟 张荣华 王继华 唐时幸

（广州万孚生物技术股份有限公司，广州 510663）

重组肌红蛋白的原核表达、纯化及其冻干质控品的制备

任艳娜 才蕾 武建伟 钱伟 张荣华 王继华 唐时幸

（广州万孚生物技术股份有限公司，广州 510663）

旨在为市场提供一种廉价、稳定、特异性强、灵敏度高的肌红蛋白质控品；将密码子优化后的肌红蛋白序列通过两步法进行化学合成，并连接到pET-28a表达载体上，转入大肠杆菌BL21（DE3），用0.5 mmol/L IPTG 37℃诱导表达；目的蛋白经Ni Sepharose 6 Fast Flow（FF）亲和层析进行纯化后，对其特异性进行检测，并研究蛋白稀释液的配方和优化冻干工艺，最后对冻干质控品的稳定性进行检测；结果显示目的蛋白分子量大小为20 kD左右，具有较强的特异性。蛋白冻干后具有很好的形态，37℃可以稳定保存10 d；25℃、4℃可以稳定保存4个月以上。该蛋白的冻干制品成本低、稳定性好、特异性强、灵敏度高，可用于定性定量肌红蛋白检测试剂盒的质控品。

重组肌红蛋白 原核表达 纯化 冻干 质控品

急性心肌梗死（Acute myocardiac infraction，AMI）是严重危害人类健康的常见疾病之一。近年来，在我国该病的发病率呈明显升高的趋势。肌红蛋白（Myoglobin，Myo）是AMI发生时最早升高的心肌损伤标志物之一，在发病2 h内血清中Myo的含量开始增加，6-9 h达到峰值。1975年，Kagen等［1］首次提出血清Myo的测定可用于急性心肌梗塞的诊断，检测病人的Myo水平可以快速确诊并及时治疗，从而降低病死率［2］。此外，Myo是判断急性心肌梗塞患者有无再灌注的最好的无创指标之一。溶栓治疗开始后90 min，如果肌红蛋白升高近4倍，则可比较准确判定梗死冠脉已完全开通。因此，肌红蛋白的检测对急性心肌梗死的诊断、预测心肌梗塞面积、指导溶栓治疗及其预后具有重要意义［3，4］。

肌红蛋白存在于哺乳动物肌肉中，具有在肌细胞内转运和贮存氧的功能［5］，由一条多肽链构成，有153个氨基酸残基和一个血红素辅基，分子量为17.8 kD［6，7］。人体心肌、骨骼肌内含有大量肌红蛋白，正常人的血液中很少，主要由肾脏代谢并排泄。肌红蛋白增高见于急性心肌梗死早期、急性肌损伤、肌营养不良、肌萎缩、多发性肌炎、急性或慢性肾功能衰竭、严重充血性心力衰竭和长期休克等［8-11］。

市场上的肌红蛋白质控品均为进口血源型人肌红蛋白，来源受限，价格昂贵，购买渠道难以保证。血源型人Myo不稳定，极易降解，严重限制肌红蛋白诊断试剂的发展［12］。虽然国内外通过基因工程手段表达重组肌红蛋白的报道很多，但所表达的Myo稳定性有待进一步提高，其表达条件仍需优化［6，13］。

1 材料与方法

1.1 材料

DNA ExTaq酶、限制性内切酶、T4 DNA连接酶购自TaKaRa公司；细菌基因组提取试剂盒、DNA回收试剂盒购自Promega公司；小量质粒提取试剂盒购自北京奇华盛；中分子量蛋白Marker、预染蛋白Marker购自Fermentas公司；甘氨酸、十二烷基磺酸钠（SDS）、甲双叉丙烯酰胺、考马斯亮兰、丙烯酰胺、IPTG购自Sigma公司；质粒pET-28a、大肠杆菌E.coliBL21（DE3）、大肠杆菌E.coliDH5α为本实验室保存；目的基因由Genewiz公司合成；肌红蛋白抗体购自Hytest公司；辣根酶标记山羊抗鼠IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司；CHRIST ALPHA1-2型冷冻干燥机购自Martin Christ公司；其它试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 表达载体pET28a-Myo的构建 通过NCBI获取人源肌红蛋白（Myo）的编码序列后，根据大肠杆菌偏爱性，运用密码子优化工具http：//www.jcat. de/Start.jsp对序列进行优化；并利用化学合成的技术手段获得目的基因片段。由Genewiz公司合成的优化密码子基因片段经BamH I和Hind III双酶切，酶切产物纯化，取3 μL与经同样限制性内切酶双酶切后的质粒pET-28a，16℃连接过夜。热激法将连接产物转化感受态大肠杆菌株E.coliDH5α，涂布于含50 μg/mL Kan+的LB平板，挑取阳性克隆经菌落PCR和酶切初步鉴定后，送Invitrogen公司测序。鉴定正确后得到重组表达载体命名为pET28a-Myo。

1.2.2 Myo的诱导表达 将测序正确并经过酶切鉴定的阳性重组质粒用热激发转化大肠杆菌E.coliBL21（DE3）感受态细胞，复苏后涂布于Kan+浓度为50 μg/mL的LB琼脂培养基上，37℃培养16 h。挑取4个单菌落接种至含50 μg/mL Kan+的5 mL LB液体培养基中，37℃，200 r/min培养过夜。次日，以1∶100比例转接于5 mL新鲜含50 μg/mL Kan+的LB培养基中，37℃，200 r/min培养至OD600≈0.8时加入IPTG至终浓度0.5 mmol/L，37℃诱导培养4-5 h。SDS-PAGE检测4株菌重组蛋白的表达情况，并筛选高效表达的重组菌株。挑选高效表达菌株进行表达条件优化和扩大培养。

1.2.3 Myo的纯化收集 扩大培养的菌体，在冰浴条件下超声破碎（超声条件为：超声5 s，间隔12 s，共超声15 min），12 000 r/min 4℃离心15 min，上清经Ni Sepharose 6 Fast Flow（FF）亲和层析纯化。上样缓冲液为20 mmol/L PB，5 mmol/L咪唑pH7.4；平衡缓冲液为20 mmol/L PB，250 mmol/L咪唑 pH7.4；洗脱缓冲液为20 mmol/L PB，500 mmol/L咪唑pH7.4。

1.2.4 Myo特异性检测 为了检测Myo的特异性和灵敏度，实验室用购自Hytest的肌红蛋白抗体1 000倍稀释后做一抗，进行Western blot检测。

在《悼亡》诗中，商景兰对于女性的家庭责任感表达了自己的见解。另一首具有重要意义的长诗《五十自叙》中，商景兰完成了对于自我的观照，第一次在诗中表明了立身处世的方向。五十而知天命，意味着个人进入了丰收的年纪，也是作者回顾过往，反省一生之时：

1.2.5 Myo的活性检测 将原浓度重组肌红蛋白分别稀释若干倍后（浓度H、浓度M、浓度L），用广州万孚生物技术公司研发的肌红蛋白检测试剂盒（荧光定量免疫层析法）对该蛋白的活性进行检测，从而确定适当的稀释比例进行后续试验。

1.2.6 Myo冻干工艺的筛选 为了增加蛋白的稳定性，筛选蛋白的冻干工艺。分别用小牛血清和健康人血浆作为稀释液，加入赋形剂和保护剂后，分别将蛋白稀释上述确定的3个浓度（浓度H、浓度M、浓度L）进行冻干，并通过冻干外观、活性收率和37℃ 1周破坏试验（在37℃恒温培养箱中，每天取出一支进行活性检测）筛选最佳冻干工艺。

1.2.7 Myo冻干样品稳定性检测 为进一步验证冻干工艺，评价该质控品的稳定性，同一批冻干样品分别于25℃、4℃放置4个月，检测冻干蛋白的实时稳定性。此外，通过37℃加速破坏试验预测冻干蛋白的长期稳定性。

2 结果

2.1 表达载体的鉴定

将重组质粒pET28a-Myo送到Invitrogen公司进行测序，结果（图1）表明连接正确，与预期结果一致。同时对提取的重组质粒进行双酶切鉴定，电泳结果可观察到一条500 bp左右的条带，说明目的片段已成功插入到表达载体pET-28a中（图2）。

2.2 Myo的诱导表达及纯化结果

按正交试验进行表达因素筛选，包括温度、诱导剂量、诱导时间、宿主菌OD值以及培养基pH值等。结果（图3）显示，以BL21（DE3）为宿主菌体，在37℃，OD600≈0.8时，加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG，37℃诱导4 h表达量最大。菌液裂解后，用Ni Sepharose 6 Fast Flow（FF）亲和层析进行纯化，上样缓冲液为20 mmol/L PB，5 mmol/L咪唑pH7.4；平衡缓冲液为20 mmol/L PB，250 mmol/L咪唑 pH7.4；洗脱缓冲液为20 mmol/L PB，500 mmol/L咪唑 pH7.4。洗脱得到的目的蛋白纯度大于95%，分子量大小正确。

2.3 Myo特异性检测结果

用购自Hytest的抗肌红蛋白抗体为一抗，以辣根酶标记山羊抗鼠IgG为二抗进行Western blot检测该重组蛋白的特异性。结果（图4）表明，表达的重组Myo可与特异性的抗肌红蛋白抗体结合，特异性良好。

2.4 Myo活性检测结果

将重组肌红蛋白原液若干倍稀释以后，用广州万孚生物技术股份有限公司生产的肌红蛋白（Myo）定量检测试剂对稀释的3个不同浓度（浓度H、浓度M、浓度L）重组肌红蛋白活性进行检测，每个浓度平行检测10支，CV值均小于10%（表1）。

2.5 Myo冻干工艺的优化

为保证蛋白运输保存的稳定性，对冻干工艺进行了初步探索。最终确定小牛血清中加3%乳糖、0.04%人血清白蛋白、20 mmol/L NaCl作为蛋白稀释液。将蛋白稀释到适当浓度，-80℃预冻4 h后，真空冻干12 h，取出加盖密封保存，其外观呈白色疏松饼状。

在此冻干方案下，活性收率（溶液冻干后活性/溶液冻干前活性）可达85%以上；37℃稳定保存10 d，冻干样品的外观仍为白色疏松饼状，活性在±25%参考范围以内。

2.6 Myo冻干样品稳定性试验结果

用广州万孚生物技术股份有限公司生产的肌红蛋白检测试剂盒（荧光定量免疫层析法）对同一冻干批次的3个不同浓度（H、M、L）的冻干样品的稳定性进行跟踪。研究发现，冻干样品在25℃、4℃可以稳定保存4个月以上（表2，表3）；37℃可以稳定保存10 d以上（表4），所测得的蛋白浓度均在起始浓度±25%参考范围之内。

3 讨论

目前，肌红蛋白测定方法很多，其敏感性和特异性不同。有放射免疫方法（RIA）、高效液相色谱法（HPLC）、滴金免疫测定法（DIGFA）、速率散射浊度法（RAN）、酶联免疫方法（ELISA）、荧光免疫法和胶乳凝集试验等［14-17］，而以上各检测方法的建立，首先都必须获得优质的肌红蛋白抗原。但目前人源肌红蛋白来源受限，重组肌红蛋白稳定性差，已成为制约肌红蛋白检测技术发展的巨大障碍［6，7，13］。张欣等［13］发表了关于基因工程重组肌红蛋白的表达的相关研究，其纯度、特异性等方面能满足要求，但稳定性仅做了重组抗原在-20℃环境中保存3个月，并没有做长途运输相关的4℃和25℃，及使用时37℃稳定性研究。安星兰［5］和崔大伟等［6］也发表了关于重组肌红蛋白的研究，但该研究表达的重组肌红蛋白主要用于下一步的免疫获得单克隆抗体，并未对稳定性及抗原反应灵敏度做任何研究。

本研究在NCBI查询得到Myo氨基酸序列的基础上，对Myo密码子经过优化得到大肠杆菌惯用的密码子序列，参照Young等［18］提出的两步法进行全基因合成的方法得到Myo基因序列。双酶切后与pET-28a连接，通过热激法将重组质粒pET-28a-Myo转入到BL21（DE3）后进行诱导表达，经Western blot及商品化检测试剂盒检测，该重组蛋白活性很高。大量发酵后，进行Ni Sepharose 6 Fast Flow（FF）亲和层析纯化，其纯度大于95%，满足生产浓度及纯度的需求。并根据实际需求研究了肌红蛋白最佳保护剂和冻干工艺，冻干样品37℃稳定性、25℃稳定性、4℃稳定性，以确保该蛋白冻干制品在常规储存及运输条件下的稳定性。

真空干燥，又名解析干燥，是一种将物料置于负压条件下，并适当通过加热达到负压状态下的沸点来干燥物料的干燥方式，是目前用于微生物、蛋白质等生物制品干燥保存的一种最常用、最有效的方法［19］。目前，常用的蛋白冻干保护剂包括糖类及多元醇、聚合物、无水溶剂、表面活性剂、氨基酸以及某些盐和胺［20］。在低温下干燥，各有效成分活性丧失少；复溶性好，能很快地吸水还原成干燥前的鲜活状态；脱水彻底，保存期长，储存运输、销售方便。但是，在真空冷冻干燥过程中，冷冻和干燥不可避免地会造成部分蛋白的损伤及降解［21，22］。为了减少冻干过程中Myo活性成分的损失，根据Myo本身的结构，通过37℃加速破坏试验对Myo的保护剂、赋形剂、缓冲液进行筛选。同时对冻干压强、湿度、冻干时间、仪器最适冻干量等进行优化，初步确定Myo的最佳冻干工艺。

为了使该肌红蛋白冻干品稳定性和冻干品复溶后稳定性达到最佳，在初步冻干工艺的基础上对保护剂、赋形剂、盐浓度进行深入研究。结果发现，保护剂人血清白蛋白浓度为0.04%时达到最佳冻干效果，降低人血清白蛋白的浓度会导致活性收率降低，提高人血清白蛋白浓度对活性收率没有明显影响，但成本明显增加；赋形剂乳糖的浓度为3%时外观形态最好，提高乳糖浓度对活性和外观无明显影响，但降低乳糖浓度冻干制品严重变形，呈玻璃状；盐浓度对肌红蛋白稳定性的影响比较大，随着NaCl浓度的升高（0-100 mmol/L），冻干制品的37℃稳定性逐渐降低，肌红蛋白冻干制品的复溶稳定性逐渐提高。随着NaCl浓度的降低（100-0 mmol/L），肌红蛋白冻干制品的37℃稳定性逐渐提高，冻干制品复溶稳定性逐渐降低。综合考虑各种因素，最终确定冻干方案（3%乳糖、0.04%人血清白蛋白、20 mmol/L NaCl）。按照此冻干工艺，冻干样品在25℃、4℃和-20℃可以稳定保存4个月以上；在37℃可以稳定保存10 d以上；复溶后在4℃和25℃分别能稳定保存6 d。

4 结论

本研究将人源肌红蛋白（Myo）的基因片段连接到表达载体pET-28a、转入BL21（DE3）后，37℃诱导表达得到活性高、特异性好的目的蛋白Myo。将纯化后的Myo按一定比例稀释后，加入赋形剂乳糖3%、保护剂人血清白蛋白0.04%、增加蛋白水化程度的中性盐NaCl 20 mmol/L，-80℃预冻4 h后，真空冻干12 h得到外观呈白色疏松饼状冻干制品。该冻干制品在25℃、4℃和-20℃可以稳定保存4个月以上；在37℃可以稳定保存10 d以上；复溶后在4℃和25℃分别能稳定保存6 d。

［1］ Kagen L, Scheidt S, Roberts L, et al. Myoglobinemia following acute myocardial infarction［J］. Am J Med, 1975, 58：177-182.

［2］ Heidenreich PA, Alloggiamento T, Melsop K, et al. The prognostic value of troponin in patients with non-ST elevation acute coronary syndromes：a meta-analysis［J］. Journal of the American College of Cardiology, 2001, 38：478-485.

［3］ Sallach SM, Nowak R, Hudson MP, et al. A change in serum myoglobin to detect acute myocardial infarction in patients with normal troponin I levels［J］. The American Journal of Cardiology, 2004, 94：864-867.

［4］ Chun D, Kim SH, Song H, et al. Fast myoglobin detection using nanofluidic electrokinetic trapping technique［J］. Applied Physics Express, 2013, 6：7001.

［5］ 安星兰.人肌红蛋白基因合成、原核表达及单克隆抗体制备［D］. 哈尔滨：东北林业大学, 2012：1-7.

［6］ 崔大伟, 王伟, 王小林, 等.人肌红蛋白基因的克隆、表达及其抗体制备［J］.中国生物制品学杂志, 2007, 20：166-169.

［7］ Varadarajan R, Szabo A, Boxer SG. Cloning, expression in Escherichia coli, and reconstitution of human myoglobin［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1985, 82：5681-5684.

［8］Kitao T, Miyaishi S, Ishizu H. Identification of human skeletal muscle from a tissue fragment by detection of human myoglobin using a double-sandwich ELISA［J］. Forensic Science International, 1995, 71：205-214.

［9］Ohman EM, Casey C, Bengtson J, et al. Early detection of acute myocardial infarction：additional diagnostic information from serum concentrations of myoglobin in patients without ST elevation［J］. Br Heart J, 1990, 63：335-338.

［10］Bekedam MA, van Beek-Harmsen BJ, van Mechelen W, et al. Myoglobin concentration in skeletal muscle fibers of chronic heart failure patients［J］. Journal of Applied Physiology, 2009, 107：1138-1143.

［11］Nitta T, Xundi X, Hatano E, et al. Myoglobin gene expression attenuates hepatic ischemia reperfusion injury［J］. Journal ofSurgical Research, 2003, 110：322-331.

［12］de Lemos JA, Morrow DA, Gibson CM, et al. The prognostic value of serum myoglobin in patients with non-ST-segment elevation acute coronary syndromes results from the TIMI 11B and TACTICS-TIMI 18 studies［J］. Journal of the American College of Cardiology, 2002, 40：238-244.

［13］张欣.重组人心肌肌红蛋白基因工程菌的构建及重组蛋白的初步纯化［D］.北京：放射医学研究所, 2008：7-10.

［14］Zhu J, Zou N, Mao H, et al. Evaluation of a modified lateral flow immunoassay for detection of high sensitivity cardiac troponin I and myoglobin［J］. Clinical Infectious Diseases, 2011, 53（4）：321-5

［15］Darain F, Yager P, Gan KL, et al. On-chip detection of myoglobin based on fluorescence［J］. Biosensors and Bioelectronics, 2009, 24：1744-1750.

［16］Gilkeson G, Stone MJ, Waterman M, et al. Detection of myoglobin by radioimmunoassay in human sera：its usefulness and limitations as an emergency room screening test for acute myocardial infarction［J］. Am Heart J, 1978, 95：70-77.

［17］Pakapongpan S, Palangsuntikul R, Surareungchai W. Electrochemical sensors for hemoglobin and myoglobin detection based on methylene blue-multiwalled carbon nanotubes nanohybrid-modified glassy carbon electrode［J］. Electrochimica Acta, 2011, 56：6831-6836.

［18］Young L, Dong Q. Two-step total gene synthesis method［J］. Nucleic Acids Res, 2004, 32：e59.

［19］王浩, 王传伟, 安源, 等.真空冷冻干燥的工艺流程［J］.医疗卫生装备, 2012, 33：90-91.

［20］Wang M, Wang Y, Wang J, et al. Construction and characterization of a novel staphylokinase variant with thrombin-inhibitory activity［J］. Biotechnol Lett, 2009, 31：1923-1927.

［21］Kasper JC, Friess W. The freezing step in lyophilization：Physicochemical fundamentals, freezing methods and consequences on process performance and quality attributes of biopharmaceuticals［J］. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 2011, 78：248-263.

［22］朱敖兰, 杨洁.生物制品冻干保护剂及其保护机理的研究进展［J］.喀什师范学院学报, 2007, 28：46-50.

（责任编辑 马鑫）

The Expression and Purification of Recombinant Myoglobin and Preparation of Its Quality Control Samples

Ren Yanna Cai Lei Wu Jianwei Qian Wei Zhang Ronghua Wang Jihua Tang Shixing
（Guangzhou Wondfo Biotech Co.，Ltd，Guangzhou 510663）

We intended to provide a cheap, stable, highly specific and sensitive lyophilized protein as quality control for diagnositic kits. The myoglobin gene code was optimized and two-step methods were used in this study for the synthesis of myoglobin gene. The DNA fragment of myoglobin was inserted into pET-28a vector forming a recombination plasmid, then, transformed into BL21（DE3）bacteria. Protein expression was induced by 0.5 mmol/L IPTG and purified by Ni Sepharose 6 Fast Flow（FF）. After confirming its specificity, we studied the stability of the lyophilized protein at different storage temperatures（37℃, 25℃, 4℃）. Results showed that the target protein is approximately 20 kD with high specificity, good morphology and stability after freeze-drying under the optimized conditions and protein diluting solution. The lyophilized myoglobin protein with low cost, good stability, high specificity and sensitivity, canbe used as quality control for both qualitative and quantitative myoglobin testing kits.

Recombinant Myoglobin Prokaryotic expression Purification Lyophilized Quality control samples

2013-12-18

任艳娜，女，硕士研究生，研究方向：兽医药理学与毒理学；E-mail：yanna052267213@163.com

唐时幸，男，博士，研究方向：生物医学；E-mail：tang.shixing@wondfo.com.cn