肽类化合物对H37Ra抑制的优化筛选

吴丛梅 李玲玲 关晓侠 刘新涛 陈吉 殷玉和

（长春工业大学化学与生命科学院，长春 130012）

肽类化合物对H37Ra抑制的优化筛选

吴丛梅 李玲玲 关晓侠 刘新涛 陈吉 殷玉和

（长春工业大学化学与生命科学院，长春 130012）

通过抑菌试验，确定不同培养基条件下多肽化合物的抑菌效果，并测定其最小抑菌浓度（Minimum inhibitory concentration，MIC）。加入Vc，比较抑菌效果，进一步优化筛选H37Ra抑制剂。先根据ELISA试验结果进行噬菌体肽库筛选，然后利用分子对接软件模拟多肽与ICL蛋白晶体（1F8I）的分子对接，将成功对接的多肽采用Fmoc固相合成法合成，并对其生物活性进行检测。用制备型反相高效液相色谱仪对合成的多肽进行纯化并进行质谱检测。共筛选得到4条多肽且均有抑菌效果，并与剂量相关。结果显示，浓度为800-1 500 μg/mL时，各组多肽均抑菌。浓度为500 μg/mL时，正常培养基中只有一种肽有抑菌作用，而限制碳源培养基中均不能抑菌。2号肽抑菌效果最好，正常培养基中MIC为200 μg/mL，限制碳源中为500 μg/mL。阳性对照组，两种培养基抑菌效果一致，利福平MIC为0.8 μg/mL，异烟肼MIC为0.5 μg/mL。根据MIC结果，在正常培养基中加入Vc，检测到多肽、利福平和异烟肼的抑菌效果呈剂量依赖性升高。

肽类化合物 MIC 噬菌体肽库 分子对接 Fmoc固相合成

结核病是结核分枝杆菌（Mycobacterium）引起的慢性传染性疾病，已有研究表明结核杆菌被巨噬细胞吞噬后，在巨噬细胞内转为持留状态，通过乙醛酸循环途径获取能量［1］。现有药物会随着患者免疫力下降或者停药，而重新致病。因此迫切需求研制新型抗结核药物。异柠檬酸裂解酶（ICL）是结核杆菌在人体内处于持续感染状态时乙醛酸支路代谢中的关键酶［2，3］，因此，本研究以ICL作为研发抗结核药物的靶点。

已知的异柠檬酸裂解酶的抑制剂能有效抑制细胞内细菌生长［4］，但其因自身结构限制，具有生物毒性，所以并不具有药用及开发价值［5］。目前还尚未发现可作为抗结核病治疗药物的异柠檬酸裂解酶抑制剂。

本研究以结核杆菌ICL作为靶点筛选可以抑制细菌生长的多肽。首先利用噬菌体肽库筛选技术［6］和分子对接技术［7，8］，优化筛选异柠檬酸裂解酶肽类抑制剂。通过测定多肽在不同培养基内的抑菌作用，确定能有效抑制细菌生长的最小抑菌浓度（Minimum inhibitory concentration，MIC）［9］。在培养基中加入Vc［10］，检测多肽的抑菌效果，旨在为以异柠檬酸裂解酶为靶点的抗结核药物研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 H37Ra菌种由中国药品生物制品检定所馈赠。

1.1.2 仪器 肽类化合物由长春工业大学ICL抑制剂试验组合成。MB7H9，DMSO均购自美国Sigma公司。利福平购自沈阳双鼎制药有限公司。异烟肼购自天津药业集团新郑股份有限公司。质谱（API400）购自上海晶能生物技术有限公司。GL3000制备型高效液相色谱仪购自成都格莱精密仪器有限公司。Peptide Synthesizer PSI 200购自美国多肽科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 单克隆噬菌体ELISA检测 用100 μg/mL的ICL靶蛋白包被96孔酶标板，4℃过夜。次日去除包被液，于4℃封闭1 h。用TBS/Tween（体积分数为0.5%）洗板，每孔分别加入10 μL待鉴定的扩增噬菌体和40 μL TBS的混合溶液，室温震荡作用1 h。洗板后每孔加入200 μL HRP标记的抗-M13抗体（封闭液中以体积比=1∶5 000稀释）［11］，室温震荡作用1 h。洗板后每孔加200 μL TMB底物溶液，室温作用约20 min，出现颜色变化后，用2 mol/L的H2SO450 μL终止反应，酶标仪记录450 nm处吸光值［12］。

1.2.2 DNA序列测定 将所提取的噬菌体单链DNA送上海生工生物工程技术服务公司进行测序。测序所得的碱基序列，通过Generunner软件翻译成所对应的氨基酸序列。

1.2.3 分子对接 从蛋白质数据库（Protein data bank，PDB）晶体结构数据中下载ICL蛋白晶体三维结构数据（1F8I.Pdb，http：//www.pdb.org）。采用程序中的LigandFit预测ICL活性位点，自动依据配体/受体复合物的能量得到最佳的配体和受体结合结构。分子对接采用Monte Carlo极小化与模拟退火方法，每次优化1 000步，并考虑溶剂化效应，采用cellmultiple模型计算非键相互作用。配体和受体间的能量匹配用半经验的自由能计算方法评价［12］。

1.2.4 肽的固相合成 采用Fmoc固相合成法，先将RinK树脂在合成仪反应器中经DMF溶胀30 min，然后逐个偶联上氨基酸残基。粗品先经制备型反相高效液相色谱仪纯化，再用质谱检测所合成的七肽。

1.2.5 H37Ra菌种培养 以含10% ADC的MB7H9（内含终浓度为0.2%的甘油）为正常生长状态的培养基，不含甘油的为限制碳源培养基。1×105Pa高压灭菌1 h，置4℃冰箱保存。临用时，加入10% ADC营养添加剂。37℃间或震荡培养2-3周。

1.2.6 菌液制备

1.2.6.1 比浊管的配制 根据菌液所需达到的浓度要求，按照表1的两种试剂量添加混匀配置标准比浊管。

1.2.6.2 细菌悬液的制备 向1.5 cm×3 cm的小瓶内放置10个6 mm的玻璃珠，加入含0.5% Tween80的生理盐水0.5 mL，121℃高压灭菌1 h。待冷却后，分别将两种培养液中培养2-3周菌龄的H37Ra株小心取出，各自用无菌PBS缓冲液洗涤3遍，去除原培养基，分别接入小瓶中，涡旋混匀，直至菌液成乳酪状，用0.5%生理盐水稀释，并与比浊管比浊配置成1 mg/mL的菌液［9］，静置备用。

1.2.6.3 最小抑菌浓度（MIC）的测定 取制备好的1 mg/mL菌悬液5 μL，含菌数量2×103，分别接种于每支含500 μL正常状态或限制碳源培养液的24孔板中，然后根据需要在孔中加入1 mL用DMSO配制的不同浓度的七肽化合物，肽浓度梯度稀释为：1 500、1 000、800、500和200 μg/mL。以利福平和异烟肼为阳性对照，浓度梯度稀释为1.5、1.0、0.8、0.5和0.2 μg/mL。以DMSO和不添加任何化合物的培养菌液作为阴性对照。同时分别添加1 mmol/L和4 mmol/L的Vc（每孔添加500 μL）做对照组，置37℃恒温孵箱内培养，2-3周观察结果。

2 结果

2.1 噬菌体阳性克隆酶联免疫吸附剂测定（ELISA）和氨基酸测序结果

将噬菌体肽库筛选所得的噬菌体铺于含IPTG/X-gal的LB平板上，于37℃过夜培养后长出的噬菌斑全部为蓝色重组斑，随机挑取其中的噬菌体克隆对其进行酶联免疫吸附剂试验（ELISA）。样品的OD450值高于阴性对照一倍即认为该样品值为阳性值。筛选出的4个阳性克隆的噬菌体ELISA检测结果均大于0.2（图1），氨基酸测序结果见表2。

2.2 分子对接结果

根据表2中七肽的氨基酸序列，进行DNA测序。利用分子对接软件中的Build and Edit Protein构建七肽的三维结构，以七肽作为配体，将ICL（1F8I）作为受体进行分子对接，筛选出来的4条七肽（编号1、2、3、4）与ICL对接成功（图2）。

2.3 肽的固相合成结果

根据氨基酸序列分析结果，确定合成以上4条七肽。用制备型反相高效液相色谱仪对合成的多肽进行纯化。纯化多肽由质谱（API400）确定其分子量（图3）。纯化结果（表2）显示，与计算分子量结果一致，说明成功合成了这4条肽链。

2.4 肽类抑制剂对H37Ra株的抑制作用

试验结果（表3）显示，在正常培养基中，所有多肽均具有抑菌性，并与剂量相关。浓度为800-1 500 μg/mL时，各组多肽（编号1、2、3和4）均抑菌。浓度为500 μg/mL时，只有2号肽有抑菌作用。在限制碳源液体培养基中培养，多肽的抑菌性也与剂量相关。浓度为800-1 500 μg/mL时，各组多肽（编号1、2、3、4）均抑菌。浓度为500 μg/mL时，均不能抑菌。

利福平和异烟肼为现有治疗结核病药物，对H37Ra均有抑制作用，其MIC均小于0.5 μg/mL，利福平浓度为0.5 μg/mL时无抑菌效果（表3）。抑菌试验中，作阳性对照，与不同浓度肽类化合物比较，观察长菌情况，并记录其最小抑菌浓度。

根据以上结果，选用正常生长状态培养基，并根据MIC浓度，4条多肽（编号1、2、3、4）做进一步检测。

2.5 Vc对H37Ra的抑制作用

在正常培养基中加入Vc，检测其对结核分枝杆菌的抑制作用。在培养基中加入500 μL Vc，在培养第4天和第11天观察结核分枝杆菌生长情况，同时设不加Vc组。结果（表4）显示，第4天，正常培养基中长菌，加入Vc后均有抑菌效果；第11天，1 mmol/L Vc不抑菌，而4 mmol/L Vc仍可抑菌。与只加多肽或Vc的培养基相比，加多肽、Vc的培养基，均可抑菌，抑菌效果随着给药剂量增加而增强，且随时间增加而增强。

3 讨论

随着越来越多的多肽药物研发批准上市，多肽的研究也越来越受到重视，已成药多肽有安塞纳肽，重组人粒细胞集落刺激因子注射液等。目前已知的异柠檬酸裂解酶的抑制剂有3-溴丙酮酸和3-硝基丙酸盐，抑制剂常数（Ki）分别为120 和3 μmol/L［13，14］。这几种化合物抑制剂可以有效地降低异柠檬酸裂解酶的活性。但是这些化合物由于自身结构等限制，具有很强的生物毒性，所以并不具有药用及开发价值。赖煦卉等［5］检测到化合物FD20的IC50值为62.2 μg/mL，具有较好的成药物理参数，并能在低浓度下有效抑制细胞内细菌生长，是非常具有成药潜力的抗结核先导化合物，但仍具有生物毒性，也不是理想的抗结核药物。目前还没有发现可作为抗结核病治疗药物的异柠檬酸裂解酶抑制剂。而多肽作为药物，与现有中药和化合物类抑制剂相比，免疫原性低、生理活性强、疗效高，副作用小、不会聚积体内而引起中毒，因此可解决化合物类生物毒性问题。

Vc是已知的一种抗氧化剂和促氧化剂，具有许多生物学功能，包括参与氨基酸代谢、增加对感染的抵抗能力、参加解毒功能、抗组胺及阻止致癌物质生成等作用。Vilcheze等［10］观察剂量反应关系表明，Vc在抑制结核分枝杆菌生长的最小抑菌浓度1 mmol/L，有短暂的抑菌效果，然后恢复性增长。由于Vc降解，每天分别添加1 mmol/L Vc，连续添加4 d对结核分枝杆菌的治疗效果和直接添加4 mmol/L Vc效果一样。Vc对结核分枝杆菌培养基的杀菌效果是由于其促氧化剂活性，亚铁离子浓度的增加导致ROS的产生，脂质的改变，氧化还原失衡和DNA损伤，进而达到杀菌效果。

本研究的抑制剂为多肽类抑制剂，以正常和限制碳源两种培养基做抑菌试验，多肽浓度梯度稀释为：1 500、1 000、800、500和200 μg/mL。同时以相同条件的DMSO为阴性对照，利福平和异烟肼为阳性对照，利福平和异烟肼浓度稀释为：1.5、1.0、0.8、0.5和0.2 μg/mL。检测到不同培养基条件的多肽均有抑菌效果，并与剂量相关。浓度为800-1 500 μg/mL时，各组多肽均抑菌。浓度为500 μg/mL时，正常培养基中只有2号肽有抑菌作用，而限制碳源培养基中均不能抑菌。这说明限制碳源时因体内代谢状态改变而导致肽类抑制剂耐药性增大。阳性对照组，两种培养基抑菌效果一致，利福平MIC为0.8 μg/mL，异烟肼MIC为0.5 μg/mL。这与已有报道中利福平为0.5 μg/mL，异烟肼为0.2 μg/mL有所不同，可能与培养基、培养条件的选择有关。

在两种培养基中加入Vc，浓度为1 mmol/L和4 mmol/L检测到多肽、利福平和异烟肼的抑菌效果呈剂量依赖性提高。给药4 d，每天分别添加1 mmol/L Vc，与直接添加4 mmol/L Vc各组抑菌效果一样，这与已有研究结果［10］一致。给药11 d，4 mmol/L Vc组仍具有抑菌效果，而1 mmol/L Vc组H37Ra恢复增长，这应与Vc降解有关。可见Vc与多肽、利福平和异烟肼一起给药对H37Ra抑制有协同效果，较单独给药具有更好的抑菌作用，但Vc作为辅助药与多肽化合物联合应用的效应及机制有待探讨，Vc给药浓度仍有待于研究。在此，选用正常培养基重复试验，对筛选出的4条多肽MIC进一步测定，检测结果合理，为以多肽类抑制剂做新型抗结核药物提供了理论依据。进一步优化筛选H37Ra抑制剂，为抗结核药物设计提供新的思路。在现有研究报告中，尚未有Vc与多肽联合应用的相关报道，可望为结核病治疗开辟新的途径。

多肽类抑制剂具有较好的成药物理参数，并且能在低浓度下有效抑制细菌生长，具有成药潜力，是理想的抗结核药物。此外，Vc来源广泛，与多肽一起联合给药抑菌克数比常规药物大10个数量级，药物半衰期延长，这在抗结核药物研究领域尚未报道，有利于下一步研究对其进行结果改造，具有广阔的应用前景。

4 结论

ICL是结核杆菌在人体内处于持续感染状态乙醛酸支路代谢中的关键酶，本研究以ICL作为研发抗结核药物的靶点。利用噬菌体肽库筛选技术和分子对接技术，成功筛选出4种ICL肽类抑制剂，通过抑菌试验测定均有抑菌活性，并与剂量相关。确定不同培养基条件下多肽化合物的MIC，进而在正常培养基中加入Vc，检测到多肽抑菌效果呈剂量依赖性升高。

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（责任编辑 马鑫）

Optimization Screening of Peptides Inhibition to H37Ra

Wu Congmei Li Lingling Guan Xiaoxia Liu Xintao Chen Ji Yin Yuhe
（School of Chemistry and Life Science，Changchun University of Technology，Changchun 130012）

By inhibition experiments to determine the inhibitory effect of peptide compounds under different culture conditions, and measure theirs minimal inhibitory concentration（MIC）. Adding Vc to compare inhibitory effect and future optimize screening H37Ra inhibitors. According to the results of ELISA test screen the phage peptide library, and then uses the Molecular docking software to simulate peptide docking with ICL protein crystal（1F8I）. The successful docking peptide uses the solid-phase synthesis method of Fmoc for synthesis, and tests its biological activity. By preparative reversed phase HPLC purifies the synthesized peptides and detects mass spectrometry. Four peptides were screened, all of which have bacteriostatic effect, and correlated with the dose. The results showed that when the concentration between 800 and 1 500 μg/mL all group were bacteriostat. When the concentration is 500 μg/mL, only one peptide has bacteriostatic effect in the normal medium, while all cannot inhibit in the limit carbon medium. The inhibitory effect of No.2 peptide is best, and its MIC is 200 μg/mL in normal culture, while it is 500 μg/mL in carbon limitations. Positive control group, two media’s inhibitory effect were consistent, RIF’s and INH’s MIC were 0.8 μg/mL and 0.5 μg/mL, respectively. According to MIC results, the inhibitory effects of peptide, RIF and INH were improved when adding Vc to the normal culture, and to be a dose-dependent increase.

Peptides MIC Phage peptide library Molecular docking Solid-phase synthesis method of Fmoc

2014-03-31

吉林省科技发展计划项目（2008110）

吴丛梅，女，教授，研究方向：生物工程学；E-mail：wucmyue@sina.com

殷玉和，男，讲师，研究方向：生物工程学；E-mail：yyhlxt72@sina.com