响应面法优化解淀粉芽孢杆菌C101发酵培养基

梁昌聪 郭立佳 刘磊 张建华 杨腊英 王国芬 黄俊生

（中国热带农业科学院环境与植物保护研究所 农业部热带作物有害生物综合治理重点实验室海南省热带农业有害生物检测与控制重点实验室，海口 571101）

响应面法优化解淀粉芽孢杆菌C101发酵培养基

梁昌聪 郭立佳 刘磊 张建华 杨腊英 王国芬 黄俊生

（中国热带农业科学院环境与植物保护研究所 农业部热带作物有害生物综合治理重点实验室海南省热带农业有害生物检测与控制重点实验室，海口 571101）

采用响应面法对解淀粉芽孢杆菌C101菌株产芽孢发酵培养基进行了优化。利用Plackett-Burman试验设计筛选出影响产孢的3个主要因素：MnSO4、KH2PO4和（NH4）2SO4。在此基础上运用最陡爬坡路径法逼近最大响应值区域，最后利用响应面分析法确定主要因子之间的交互作用及最佳条件。结果表明，蔗糖20 g/L，尿素4.0 g/L，豆粕4.0 g/L，KNO32.0 g/L，Na2HPO42.4 g/L，KH2PO40.52 g/L，（NH4）2SO40.55 g/L，NaCl 1.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.50 g/L，FeSO40.005 0 g/L，MnSO40.005 4 g/L，C101最大理论芽孢含量为14.67×108个/mL。经3次平行试验验证，实际平均芽孢含量与预测芽孢含量相近，比之前的芽孢含量提高了188%。

响应面法 解淀粉芽孢杆菌 芽孢 优化

解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）是一种具有广谱抑菌活性的细菌，具有较强的次生代谢产物产生能力，能抑制尖孢镰刀菌［1］等多种植物病原真菌。解淀粉芽孢杆菌C101是中国热带农业科学院环境与植物保护研究所微生物资源研究与利用课题组从香蕉根际土壤中分离获得的拮抗镰刀菌的菌株，对香蕉枯萎病等植物病害有明显的防治效果（待发表），应用前景广阔。

目前国内外对解淀粉芽孢杆菌发酵的优化主要集中在产抗菌脂肽［2-4］、α-淀粉酶［5］、蛋白酶［6］等酶类物质，较少研究解淀粉芽孢杆菌数量发酵优化；而研究此类菌数量发酵优化中，多数研究的目标在于提高单位体积发酵液活菌数量［7，8］，对提高芽孢数量研究较少。但从微生物菌剂的保存、使用角度考虑，芽孢数量较活菌数量在生产上更具实际意义。

本研究采用Minitab16软件中的Plackett-Burman设计法、爬坡路径法和响应面分析方法（Response surface methodology，RSM）相结合，对前期筛选获得的一株解淀粉芽孢杆菌C101进行发酵培养基的优化，以提高解淀粉芽孢杆菌C101的芽孢产量为目标，旨在为该菌株的工业化生产提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 解淀粉芽孢杆菌C101，从香蕉根际土壤中分离获得，由本实验室保藏。

1.1.2 培养基 液体种子培养基（NA液体培养基）：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10 g，NaCl 5.0 g，补水至1 000 mL，pH7.0。初始发酵培养基：蔗糖20 g，尿素4.0 g，豆粕4.0 g，KNO32.0 g，Na2HPO42.4 g，KH2PO41.5 g，（NH4）2SO41.0 g，NaCl 1.0 g，MgSO4·7H2O 0.50 g，FeSO40.005 0 g，MnSO40.002 0 g，补水至1 000 mL，pH7.0。

1.2 方法

1.2.1 发酵条件 250 mL三角瓶装50 mL培养基，初始pH7.0，高压灭菌20 min。以体积分数为5%接种量转接液体菌种，置于37℃，180 r/min的摇床进行发酵培养；48 h后对发酵液中芽孢含量进行测定。

1.2.2 培养基的优化 通过Minitab16软件中Plackett-Burman设计法筛选出对影响芽孢产量的重要因子，再通过爬坡路径法和响应面分析对重要因子的水平进行优化。

1.2.2.1 Plackett-Burman设计法 选取培养基的15个（4个空项）组分，以试验次数为20的Plackett-Burman设计法分析发酵培养基中影响芽孢产量的重要因子。将初始发酵培养基中的11个组分作为影响因素进行全面考察，选择15因子2水平的试验设计，以D、H、L、P为空项以估计试验误差，每个因素取高低两个水平（表1）。

1.2.2.2 爬坡路径法 根据Plackett-Burman设计的试验结果，安排爬坡试验。以适当的梯度改变重要影响因子在发酵培养基中的质量浓度，其他组分取低水平即初始发酵培养基的质量浓度，测定发酵液芽孢量变化趋势，确定最适质量浓度范围。

1.2.2.3 响应面分析 运用Box-Behnken的中心组合设计原理，以最陡爬坡试验得到的中心点对Plackett-Burman试验确定的3个显著性影响因子各取3水平。设计了3因素3水平共15个试验点进行响应面分析。

1.2.2.4 验证试验 用所得到的最佳培养条件进行3次平行试验，取平均值，以验证模型是否可靠，进而得出最终优化结果。

1.2.3 芽孢计数方法 将待计数样品于80℃水浴处理15 min后，再采用平板菌落计数法计数，所得计数结果即芽孢数［9］。

1.2.4 数据分析 每个处理包含3个独立重复，取3个重复实验的平均值。利用 Minitab16软件进行Plackett-Burman试验和 Box-Behnken设计响应面分析。

2 结果

2.1 Plackett-Burman试验设计结果分析

通过不同组合观察发酵液中芽孢的含量，试验设计及结果见表2。Plackett-Burman设计的各因素水平及效应评价（表3）显示，从P值大小可以看出，对发酵液含菌量具有显著影响的因子依次是O＞F＞J，即MnSO4＞KH2PO4＞（NH4）2SO4，确定这3个因素作为下一步试验的关键因素。

2.2 最陡爬坡试验

Plackett-Burman试验结果可知，MnSO4、KH2PO4和（NH4）2SO4是影响发酵液芽孢产量的重要因子，MnSO4是正效应因子，应依次增大；而KH2PO4、（NH4）2SO4是负效应，应依次减小。对3种重要影响因子进行爬坡路径试验，确定此3种因子的最适质量浓度范围。结果（表4）显示，随MnSO4浓度的增加，KH2PO4、（NH4）2SO4浓度的减少，C101发酵液芽孢含量的变化趋势先上升后下降。当MnSO40.005 5 g/L、KH2PO40.5 g/L、（NH4）2SO40.5 g/L时，对应的发酵液芽孢含量达到最大值，为3因子的最大响应值区域，以此为中心点进行响应面分析。

2.3 响应面设计结果分析

3个重要因子的最适浓度范围确定之后，以MnSO40.005 5 g/L、KH2PO40.5 g/L、（NH4）2SO4硫酸铵0.5 g/L为中心点实施响应面分析，各自变量水平见表5。根据Box-Behnken中心组合设计原理，设计3因子3水平的响应面分析试验，中心点设置3次重复，试验设计及结果分析见表6和表7。

该二次模型多元相关性系数R2= 0.989 2，表明仅有1.08%的变异不能由此模型解释；回归模型P值（prob＞F）=0.000 表明模型是显著的，失拟项P值为0.896，表明失拟不显著，模型没有失拟现象。模型的线性、平方对芽孢数的影响是显著的，交互作用对芽孢数的影响不显著。经回归拟合后，得到二次多项式方程：Y=-161.408+52212.6X1+45.5311X2+85.6 575X3-4622149X1*X1-44.9895X2*X2-62.9579X3*X3-544.737X1*X2-3815.79X1*X3+7.66667X2*X3

根据上述拟合回归方程，通过软件分析得到相应的响应面分析图和相应的等高图（图1-图3）。图1-A显示，当固定（NH4）2SO40.5 g/L时，KH2PO4从0.2 g/L 增大至 0.6 g/L，MnSO4从0.004 5 g/L 增大至0.006 5 g/L 的过程中，发酵液芽孢含量均呈现先增大后减小的趋势，曲面的顶点即为芽孢含量最大值点。图1-B显示，KH2PO4与MnSO4两因子交互作用显著。同理，图2和图3中的曲面分别反映了（NH4）2SO4和MnSO4、（NH4）2SO4和KH2PO4的交互作用。

2.4 验证试验

利用Minitab16中的响应优化器解得最优值点为MnSO40.005 4 g/L、KH2PO40.52 g/L、（NH4）2SO40.55 g/L时，预测的最大芽孢数为14.67×108个/mL。为证实预测结果，在该浓度下进行重复摇瓶试验，重复3次，结果分别为15.01×108个/mL、14.65×108个/mL、14.51×108个/mL，平均值为（14.69±0.17）× 108个/mL与预测值14.67×108个/mL接近，二者的良好拟合性证实了模型的有效性。优化后得到解淀粉芽孢杆菌C101菌株的发酵培养基配方为：蔗糖20 g，尿素4.0 g，豆粕4.0 g，KNO32.0 g，Na2HPO42.4 g，KH2PO40.52 g，（NH4）2SO40.55 g，NaCl 1.0 g，MgSO4·7H2O 0.50 g，FeSO40.005 0 g，MnSO40.005 4 g，水1 000 mL。

3 讨论

微生物发酵产品成功实现工业化的重要环节之一是发酵培养基的优化。由于Plackett-Burman（PB）设计法可以从众多的考察因素中快速、有效的筛选出最为重要的几个因素［10］，因此广泛应用于微生物发酵培养基的优化筛选。响应面分析法（RSM）是用来对受多个变量影响的响应值进行优化的一种回归分析方法，由于所需试验次数少、周期短、能确定多种因素间的交互作用，并可通过多元二次回归方程精确预测最终产量，已被广泛应用于微生物发酵领域［11］。目前，利用该方法对不同微生物的发酵培养基进行优化，均不同程度地提高目标产物的产量。唐志红等［12］利用响应面分析法优化YDX-1菌株的发酵条件，纤维素酶活性提高了 81.97%。孙力军等［3，4］用RSM对解淀粉芽孢杆菌ES-2液体发酵抗菌脂肽的培养基及其主要影响因子进行了筛选，发现 PDB 和 Landy 培养基都是 ES-2 菌株抗菌脂肽产生和积累的较好的培养基。花玉鹏等［13］对 RSM 优化发酵培养基进行了研究，结果表明，通过优化纳他霉素产量提高了 32.9%-34.8%。陆继臣等［14］对RSM优化培养基进行了研究，表明通过优化后，生防菌CNY-04 的OD600较优化前提高了 30.9%。这表明，响应面分析法是一种科学、合理的优化分析方法。

有效活菌数是衡量微生物菌剂品质的重要指标，但是微生菌剂随着保存时间的延长，活菌数量不断减少，有效活菌数降低，影响微生物制剂的使用效果。芽孢是产芽孢细菌在生长过程中形成的一种抗逆休眠体，由于芽孢不进行新陈代谢活动，能经受多种环境伤害，包括高盐、高渗、热、紫外线、多种溶剂、酸、碱等试剂的处理［15］，因此芽孢能延长微生物菌剂的保存期。目前报道的解淀粉芽孢杆菌发酵的活菌数可达109-1010CFU/mL，但均未提及对芽孢数量的提高，如车晓曦等［8］通过响应曲面优化解淀粉芽孢杆菌的发酵产量的区间，活菌数量达3.0×109CFU/mL，车晓曦等［16］通过优化解淀粉芽孢杆菌发酵培养基和培养条件，活菌数量达46×109CFU/mL，张荣胜等［7］通过优化解淀粉芽孢杆菌的发酵培养基和培养条件，活菌数量达到3.75×109CFU/mL。本研究在最佳培养基组合下，淀粉芽孢杆菌C101实际芽孢含量达到14.69×108个/mL，与理论最大芽孢含量14.67×108个/mL接近，说明运用响应面法优化淀粉芽孢杆菌C101液体发酵芽孢含量是合理可靠的。经优化，芽孢含量比优化前提高了188%。

本试验通过对解淀粉芽胞杆菌C101发酵培养基的优化为其高产发酵芽孢工艺奠定了基础，在实际发酵过程中该发酵参数有待于进一步验证。

4 结论

本研究通过Plackett-Burman设计，快速有效地从11个影响解淀粉芽孢杆菌C101产芽孢的因素中筛选出3个显著性影响因素：MnSO4、（NH4）2SO4和KH2PO4，然后利用最陡爬坡法逼近最大响应值区域，并用 Box-Behnken设计得出最佳培养基组合：蔗糖20 g，尿素4.0 g，豆粕4.0g，KNO32.0 g，Na2HPO42.4 g，KH2PO40.52 g，（NH4）2SO40.55 g，NaCl 1.0 g，MgSO4·7H2O 0.50 g，FeSO40.005 0 g，MnSO40.005 4 g，水1 000 mL。

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（责任编辑 马鑫）

Optimization of Fermentation Medium by Bacillus amyloliquefaciens Strain C101 Using Response Surface Methodology

Liang Changcong Guo Lijia Liu Lei Zhang Jianhua Yang Laying Wang Guofen Huang Junsheng
（Environment and Plant Protection Institute，CATAS/ Key Laboratory of Integrated Pest Management on Tropical Crops，Ministry of Agriculture/ Hainan Key Laboratory for Monitoring and Control of Tropical Agricultural Pests，Haikou 571101）

The fermentation medium components for spore content byBacillus amyloliquefaciensstrain C101 was optimized by response surface methodology（RSM）. Firstly, three of the most significant influence factors were screened by the method of Plackett-Burman design as MnSO4, KH2PO4and（NH4）2SO4. The path of steepest ascent was applied to approach the optimal region of the three significant factors. Lastly, the optimal concentration and correlations among three factors were identified by RSM. The optimal fermentation conditions were determined as followed：sucrose 20 g/L, urea 4.0 g/L, soybean meal 4.0 g/L, KNO32.0 g/L, Na2HPO42.4 g/L, KH2PO40.52 g/L, （NH4）2SO40.55 g/L, NaCl 1.0 g/L, MgSO4·7H2O 0.50 g/L, FeSO40.005 0 g/L, MnSO40.005 4 g/L. Under these conditions, the maximum theoretic spore number was 14.67×108/mL. After three parallel verifications, the maximum theoretic value was consistent with mean value of verification test and the spore number was increased by 188% compare to that before optimization.

Response surface methodology（RSM）Bacillus amyloliquefaciensSpore Optimization

2013-11-06

国家公益性行业（农业）科研项目（200903049）

梁昌聪，男，硕士，助理研究员，研究方向：生物农药；E-mail：lcconghn@163.com

黄俊生，研究员，研究方向：植物保护和植物病理；E-mail：h888111@126.com