重组β-环糊精葡萄糖基转移酶生产β-环糊精的工艺条件优化

杨玉路王蕾陈晟吴敬

（1.江南大学 食品科学与技术国家重点实验室，无锡 214122；2.江南大学生物工程学院 工业生物技术教育部重点实验室，无锡 214122）

重组β-环糊精葡萄糖基转移酶生产β-环糊精的工艺条件优化

杨玉路1，2王蕾1，2陈晟1，2吴敬1，2

（1.江南大学 食品科学与技术国家重点实验室，无锡 214122；2.江南大学生物工程学院 工业生物技术教育部重点实验室，无锡 214122）

将来自于Bacillus circulans251的β-CGTase编码基因克隆到表达载体pET-20b（+），转化Escherichia coliBL21（DE3）。经酶活检测培养基上清中的β-CGTase酶活为20 U/mL。对酶转化淀粉生成β-环糊精的反应条件进行了优化，结果表明，当底物马铃薯淀粉浓度15%，反应初始pH5.5，温度30℃，加酶量10 U/g干淀粉，环己烷浓度2.5%-5%（V/V），转化周期24 h，β-环糊精转化率达到最高值75.3%，是国内外报道的酶法生产β-环糊精的最高水平。

环糊精葡萄糖基转移酶 β-环糊精 酶转化 重组表达 淀粉

环糊精（cyclodextrin，简称CD），是由D-吡喃葡萄糖单元通过α-1，4糖苷键连接而成的环状低聚糖的总称，常见的环糊精由6、7和8个葡萄糖单元组成，分别称为α-、β-和γ-CD［1-4］。由于CD分子具有内部疏水、外部亲水的特性，使其能容纳与其大小和形状合适的疏水性分子或基团而形成包合物，改变这些被包埋物质的溶解度、挥发性及化学反应性能等理化性质，因而在食品［5］、医药、化学、农业、分析化学以及环保［6］等领域有着广泛的应用。β-环糊精因其溶解度低，较易沉淀，在3种环糊精中最容易实现大规模的工业生产。

环糊精主要是由环糊精葡萄糖基转移酶（cyclodextrin glycosyltransferase，CGTase，EC.2.4.19）作用于淀粉、糖原、麦芽寡聚糖等葡萄糖聚合物［7-10］等底物，通过环化反应而生成。大多数情况下，CGTases进行环化反应可以同时产生α-［11］、β-［12-15］和γ-环糊精［16，17］，但通过添加不同的有机溶剂可以选择性沉淀特定的环糊精，从而得到高纯度的特定环糊精，如添加一定浓度的环己烷、甲苯、叔丁醇可以提高β-环糊精的比例和转化率［18，19］。

本研究将来自于Bacillus circulans251［20-22］的β-CGTase基因（βcgt）连接到表达载体pET-20b（+），获得重组质粒pET-20b（+）-βcgt，将其转化Escherichia coliBL21（DE3）［23］并进行摇瓶发酵，测定培养基上清中的β-CGTase酶活力，旨在对酶转化工艺进行研究，获得高效生产β-环糊精的方法，开发β-环糊精用酶。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与质粒 大肠杆菌（Escherichia coli）JM109、大肠杆菌BL21（DE3）、表达载体pET-20b（+），为本实验室保藏；大肠杆菌BL21（DE3）含pET-20b（+）空载体为对照菌种，由本实验室构建及保藏；目的基因βcgt为上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.1.2 培养基 LB培养基（g/L）：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10，氨苄青霉素0.1，pH7.0。TB培养基（g/L）：蛋白胨12，酵母粉24，甘油5，K2HPO42.34，KH2PO416.43，氨苄青霉素0.1，甘氨酸7.5，pH7.0。

1.1.3 试剂 质粒小量提取试剂盒、氨苄青霉素购自上海生工生物工程公司；胶回收试剂盒、NcoI、Hind III、T4连接酶购自TaKaRa公司；α-，β-，γ-环糊精标样购自Sigma公司；其他试剂为国产分析纯。

1.1.4 主要仪器 凝胶成像仪，蛋白电泳仪购自美国Bio-Rad公司；DYY-6C型电泳仪购自北京六一仪器厂；高效液相色谱仪购自Agilent公司；细胞破碎仪购自北京科实兴业科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 工程菌的构建 将携带目的基因βcgt的质粒pGE-βcgt经NcoⅠ和Hind Ⅲ双酶切后，将目的基因片段割胶回收，采用T4连接酶将目的基因和同样酶切处理的表达载体pET-20b（+）连接，连接产物转入E.coliJM109感受态细胞中，在平板培养基培养过夜后，挑取单克隆液体培养，然后提取质粒得到重组表达载体pET-20b-βcgt。将表达载体pET-20b-βcgt进行双酶切验证，验证正确后转入E.coliBL21（DE3）感受态细胞中，涂布LB平板培养基，挑选单克隆，培养过夜，-80℃甘油管保存。

1.2.2 摇瓶发酵生产β-CGTase 种子培养：从-80℃保存的甘油管接一定量的菌液至LB培养基，37℃、200 r/min，培养8 h。

摇瓶发酵：将种子液以5%的接种量接入TB培养基，37℃培养至OD600约为1.5时，加入终浓度为0.1 mmol/L的IPTG同时降温至25℃进行重组蛋白的诱导表达，转速200 r/min，培养60 h。离心收集上清，即为β-CGTase粗酶液。

超声破壁：用25 mmol/L，pH5.5的Na2HPO4-KH2PO4缓冲液将细胞沉淀复溶到OD600为5，用细胞破碎仪进行破壁处理，离心收集破壁上清检验β-CGTase胞内表达情况。

1.2.3 β-CGTase环化活性测定 利用环糊精可以包埋酚酞的性质，采用比色法测定酶活［10，22，24］。用25 mmol/L，pH5.5的Na2HPO4-KH2PO4缓冲液配制1%的可溶性淀粉作为底物，取2 mL底物溶液，50℃孵育10 min，加入0.1 mL适当稀释的粗酶液，以缓冲液为空白对照，精确反应10 min，加入0.2 mL 0.6 mol/L HCl终止反应，然后加入0.5 mL 0.6 mol/L Na2CO3调pH至10.0，25℃条件下，加入0.2 mL 1.2 mmol/L酚酞溶液显色15 min，在550 nm处测定吸光值。一个酶活单位（U）定义为在上述测定条件下1 min内生成1 μm β-环糊精所需要的酶量。

1.2.4 β-CGTase酶学性质检测 最适温度和温度稳定性：采用25 mmol/L柠檬酸-Na2HPO4（pH5.5）缓冲液，在30-75℃范围内每隔5℃测定β-CGTase酶活，确定酶的最适温度，将酶活最高的计为100%，计算各温度下的相对酶活；在25 mmol/L柠檬酸-Na2HPO4（pH5.5）缓冲液中，将酶置于上述温度下保温6 h，测定残留酶活以确定酶的热稳定性。

最适pH和pH稳定性：在50℃，pH4.0-8.0范围内每隔0.5个pH测定β-CGTase酶活，确定酶的最适pH，以酶活最高的计为100%，计算其它pH条件下酶的相对酶活；将酶在上述pH缓冲液中于4℃放置12 h，测定残留酶活以确定酶的pH稳定性。

1.2.5 β-环糊精的生产以及含量测定 用0.2 mol/L，pH5.5的醋酸钠-醋酸缓冲溶液配制15%（W/V）淀粉溶液，沸水浴中加热糊化10 min，冷却至反应温度后添加一定量的β-CGTase和有机溶剂，充分混匀后在30℃、150 r/min水浴摇床中反应24 h。转化后的液体加热灭酶后，蒸馏除去有机溶剂，蒸馏液与95%乙醇1∶1混匀，静置2 h，12 000 r/min离心20 min，除去未转化的糊精，取10 μL上机分析。采用HPLC进行产物分析的色谱条件是：Agilent1200 HPLC色谱仪，Agilent自动进样器，色谱柱250×4.6 mm 5 μm Hypersil APS-2 Column，Agilent示差检测器；流动相为乙腈∶水（65∶35），流速0.8 mL/min；柱温40℃。转化率定义为生成的β-环糊精的质量比上底物的质量乘以100%。

1.2.6 β-环糊精的提取及分析 转化之后的反应液经加热灭酶后进行水蒸气蒸馏，除去其中的有机溶剂，水蒸气蒸馏液经过滤以后加热蒸发，浓缩至饱和状态，晶体析出，采用冷冻干燥法获得β-环糊精的粉末，然后进行红外光谱鉴定分析。

2 结果

2.1 高产β-CGTase重组菌的构建

2.1.1 重组质粒pET-20b-βcgt 的构建 携带有目的基因的质粒pGE-βcgt和本实验室质粒pET-20b（+）分别经NcoⅠ和Hind Ⅲ双酶切后，将目的基因片段和pET-20b（+）胶回收、连接，转入E.coliJM109感受态细胞，抽提质粒。重组质粒经NcoⅠ和HindⅢ双酶切验证，结果（图1）显示，在约3 700 bp和2 000 bp处有条带，分别和载体及基因大小一致，表明重组表达载体pET-20b-βcgt构建成功。

2.1.2 重组菌E.coliBL21（DE3）/ pET-20b-βcgt的构建和培养 表达载体pET-20b-βcgt转化进入E.coliBL21（DE3）感受态细胞中，在LB平板培养基培养，挑取单菌落接种至LB培养基培养过夜，转接TB培养基，经0.1 mmol/L IPTG诱导表达，发酵60 h后离心取上清，得到粗酶液，经检测，β-CGTase胞外酶活为20 U/mL，破壁上清的酶活仅为1.38 U/mL，表明90%以上的β-CGTase都分泌到胞外，而携带空载体的对照菌未检测到酶活。SDS-PAGE电泳条带（图2）显示，试验菌株发酵上清液蛋白（泳道1）显示大约在70 kD处出现一条蛋白条带，与理论β-CGTase分子量相符，而对照菌株发酵上清液蛋白（泳道2）处无条带，表明β-CGTase在E.coliBL21（DE3）中成功表达。

2.2 重组β-CGTase酶学性质初步研究

2.2.1 温度对β-CGTase活性和稳定性的影响 温度对酶活影响（图3）显示，重组β-CGTase的最适温度为60℃，在50-65℃酶活可保持在85%以上，当温度升高到70℃时，酶活下降至原来的50%。热稳定性结果（图4）显示，在不同温度下保温6 h以后，随着温度升高，残留酶活越来越低，在30℃和40℃时，残留酶活高达90%，稳定性良好，但是高于50℃，残留酶活降至30%以下，表明该酶对高温的耐受性不好。

2.2.2 pH对β-CGTase活性和稳定性的影响 pH对β-CGTase活性影响结果（图5）显示，重组β-CGTase的最适pH值为5.5，pH在5.5-7.0之间酶活可保持在80%以上，高于7.0和低于5.5酶活都降至60%以下。pH对酶活稳定性（图6）显示，经过12 h保温后，pH在5.5-7.0之间残留酶活都保持在80%以上，表明该酶的活性在此pH范围内稳定性良好；而在其他pH条件下，残留酶活降至30%以下，表明该酶在过酸或过碱条件下耐受性不好。

2.3 重组β-CGTase制备β-环糊精转化条件优化

2.3.1 反应温度对酶转化的影响 以15%马铃薯淀粉为底物，加酶量为每克干淀粉5 U，5%（V/V）环己烷，分别在30、40、50和60℃水浴摇床中转化24 h，蒸馏除去环己烷，HPLC检测β-环糊精生成量。如表1所示，低温条件下，副产物比率明显下降，转化率也明显上升，最高值为71.8%。这是因为低温有利于酶的稳定及β-环糊精的特异性包埋沉淀，而高温时酶的热稳定性较差，反应过程中酶已失活，导致转化率较低，所以30℃为最佳转化温度。以下试验都将温度定为30℃。

2.3.2 有机试剂及浓度对酶转化的影响 以15%马铃薯淀粉为底物，加酶量为每克干淀粉5 U，分别加入2.5%、5%、7.5%和10%（V/V）环己烷、甲苯以及无水乙醇，置于30℃水浴摇床，转化24 h，蒸馏除去有机试剂，HPLC检测β-环糊精生成量。如表2所示，环己烷和甲苯可以显著提高β-环糊精的比例，分别比不加有机溶剂的转化率提高了40.4%和39.3%，并且从产物的特异性方面来看，环己烷比甲苯更有利于β-环糊精的生产；而乙醇对β-环糊精产量的提高不是很明显，虽然总转化率有所提升，但是特异性效果较差。对于环己烷和甲苯，加入不同的浓度对转化率影响不大，而环己烷的毒性和沸点都低于甲苯，所以应该选择2.5%-5%的环己烷。

2.3.3 底物种类对酶转化的影响 分别配制15%的马铃薯、木薯、蜡质玉米淀粉，加酶量为每克干淀粉5 U，5%（V/V）环己烷，置于30℃水浴摇床，转化24 h，蒸馏除去环己烷，HPLC检测β-环糊精生成量。如表3所示，马铃薯淀粉作为底物时，环糊精总转化率为71.9%，比蜡质玉米淀粉和木薯淀粉分别提高了10%和10.7%，而生产β-环糊精的特异性也稍高于另外两种淀粉。结果表明，马铃薯淀粉作为底物最合适。

2.3.4 马铃薯淀粉浓度对酶转化的影响 分别配制5%、10%、15%和20%马铃薯淀粉，加酶量为每克干淀粉5 U，5%（V/V）环己烷，置于30℃水浴摇床，转化24 h，蒸馏除去环己烷，HPLC检测β-环糊精生成量。如表4所示，随着马铃薯淀粉浓度的增大，环糊精总转化率虽然越来越低，但是β-环糊精在产物中所占比例越来越高。综合考虑产品中β-环糊精比例和产率，本着节省资源，降低工业成本的原则，应选择15%-20%浓度为宜。

2.3.5 反应时间对酶转化的影响 以15%马铃薯淀粉为底物，加酶量为每克干淀粉5 U，5%（V/V）环己烷，置于30℃水浴摇床，定时取样，检测β-环糊精生成量。如表5所示，随着转化时间的延长，β-环糊精的特异性有所提高，在18 h之后转化率提高的幅度不大，总转化率在24 h时达最高值，为71.1%，所以可将转化时间定为24 h。

2.3.6 反应初始pH对酶转化的影响 分别用pH4.0-7.0的醋酸缓冲液配制15%马铃薯淀粉，加酶量为每克干淀粉5 U，5%（V/V）环己烷，置于30℃水浴摇床，转化24 h，蒸馏除去环己烷，HPLC检测β-环糊精生成量。如表6所示，当初始pH为5.5时，环糊精总转化率最高，为72.5%。但初始pH在5.0-7.0 内对环糊精的特异性和转化率影响不是很大，可能是因为酶在上述pH范围内比较稳定，能够保持较高的活性。

2.3.7 加酶量对酶转化的影响 以15%马铃薯淀粉为底物，在30℃水浴条件下，加入不同量的β-CGTase，加酶量分别为每克干淀粉2.5、5.0、7.5和10.0 U，5%（V/V）环己烷，转化24 h，蒸馏除去环己烷，HPLC检测β-环糊精生成量。如表7所示，随着加酶量的增多，环糊精总转化率逐渐增大，β-环糊精的特异性也有所提高，但是在加酶量为5.0 U/g干淀粉之后，转化率增大的不明显，最高为10 U/g，此时总转化率高达76.8%，而β-CD所占比例也达到最高值，为98.1%。综合考虑特异性、转化率及经济性因素，可以选择加酶量为每克干淀粉5 U。

3 讨论

早在1994年，荷兰的Catherine等［25］就克隆表达了来自于Bacillus circulans251的CGTase，并研究了此重组酶的结构，该酶显示出了与来自于Bacillus circulans8的CGTase 75%的同源性。随后，Ronald等［21］又对该酶的晶体结构进行了详细的解析，Penninga等［22］则是在195位酪氨酸处做了定点突变，从而考察该位点对形成特定产物的重要作用。在上述研究的基础上，本研究重点考察该酶的工业化应用，在E.coliBL21（DE3）中成功表达了来源于Bacillus circulans251的CGTase，酶活为20 U/mL，胞外表达量达90%以上。下一步研究重点是将该重组菌在3 L发酵罐中进行优化，获得更高表达量的酶液。

我国对于CGTase转化淀粉生成环糊精的研究还不是很多，王雁萍［7］以5%马铃薯淀粉为底物，加入10%乙醇，转化24 h，环糊精转化率可达57.97%。王俊英等［26］用嗜碱芽孢杆菌来源CGTase转化5%的可溶性淀粉，β-CD的转化率仅为40%。国外的研究相对多一些，Jemli等［27］以10%马铃薯淀粉作为底物，用Paenibacillus pabuliUS132来源的CGTase进行催化，环糊精总产量达42 g/L，β-CD占63%；Sian等［28］用alkalophilicBacillussp. G1来源的CGTase转化木薯淀粉，环糊精总产量达4.25 g/L，β-CD比例高达89%；对于Bacillus circulans251来源的CGTase，Blackwood等［18］也只将β-CD的比例提高到82%。本研究在考察了温度对酶转化的影响的基础上，对其他的影响条件，如有机溶剂、转化时间、加酶量等进一步考察，最终把β-CD的转化率提高到75.3%，而β-CD占总环糊精的比例也高达98.1%，均高于上述研究。同时，该工艺流程简单，操作方便，这为β-CD的工业化生产奠定了坚实的基础，具有广阔的实际应用前景。

此外，段续果等［11］通过异淀粉酶与α-CGTase复配，将环糊精的转化率由60.36%提高到84.63%，Rendleman等［29］尝试不同的底物和脱支酶，环糊精的转化率最高可达90%以上。鉴于该重组酶转化的pH范围比较宽，在后续的工作中考虑将脱支酶与CGTase进行复配，以此提高产物的转化率。

4 结论

本研究成功获得了能够分泌表达β-CGTase的重组E.coliBL21（DE3）菌株，初步试验表明重组菌发酵上清液中β-CGTase酶活可达20 U/mL。采用该重组β-CGTase优化了酶法生产β-CD的工艺条件。结果表明，最优条件为底物马铃薯淀粉浓度15%，反应pH5.5，温度30℃，加酶量10 U/g干淀粉，环己烷浓度2.5%-5%（V/V），转化时间24 h，β-CD总转化率可达75.3%，且β-CD占总环糊精的比例高达98.1%。

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（责任编辑 马鑫）

Optimization of β-cyclodextrin Production by Recombinant β-cyclodextrin Glycosyltransferase

Yang Yulu1，2Wang Lei1，2Chen Sheng1，2Wu Jing1，2
（1. State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122；2. School of Biotechnology and Key Laboratory of Industrial Biotechnology Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122）

The βcgtgene encoding β-CGTase fromBacillus circulansstrain 251 was cloned into the expression vector pET-20b（+）. The vector was then transformed intoEscherichia coliBL21（DE3）for extracellular production of β-CGTase. The activity in the supernatant of recombinantE. coliBL21（DE3）was 20 U/mL. Furthermore, the condition for β-cyclodextrin（β-CD）preparation by this recombinant β-CGTase was optimized. At 15% potato starch, pH5.5, 30℃, 2.5%-5%（V/V）cyclohexane, 10 U β-CGTase per gram substrate incubated for 24 hours, 75.3% of the starch was transformed into β-CD. This is the highest level of β-CD conversion by enzyme method at home and abroad.

Cyclodextrin glycosyltransferase β-cyclodextrin Enzymatic conversion Recombinant expression Starch

2014-01-20

国家自然科学基金项目（31100048）

杨玉路，女，硕士研究生，研究方向：环糊精葡萄糖基转移酶；E-mail：llyang08k3232@163.com

吴敬，女，博士生导师，研究方向：食品与发酵；E-mail：jingwu@jiangnan.edu.cn