兰州大尾羊MAPK13基因cDNA克隆及生物信息学分析

金方园徐红伟达小强臧荣鑫柏家林曹忻蔡勇冯玉兰杨具田

（1. 西北民族大学生命科学与工程学院，兰州 730030；2. 西北民族大学实验中心，兰州 730030）

兰州大尾羊MAPK13基因cDNA克隆及生物信息学分析

金方园1徐红伟2达小强1臧荣鑫1柏家林1曹忻2蔡勇2冯玉兰1杨具田2

（1. 西北民族大学生命科学与工程学院，兰州 730030；2. 西北民族大学实验中心，兰州 730030）

克隆兰州大尾羊促分裂素原活化蛋白激酶MAPK13基因，并分析其序列及其编码蛋白的生物学特性，为研究绵羊MAPK13基因的功能和生产应用提供参考。根据绵羊MAPK13基因CDS序列设计特异引物，利用RACE和RT-PCR技术克隆获得兰州大尾羊MAPK13基因全长序列，并结合生物信息学方法分析其生物学特性。克隆获得兰州大尾羊MAPK13基因cDNA 序列全长1 397 bp，其CDS区片段长1 102 bp，编码367个氨基酸。预测兰州大尾羊MAPK13蛋白分子量为42.29 kD，理论等电点为8.82，为非跨膜的疏水性蛋白，亚细胞定位主要在细胞质中，无信号肽，不属于分泌蛋白。预测其氨基酸序列有19个磷酸化位点，3个糖基化位点，3个磷酸化功能结构域，4个其他结构域，1个LCR片段，二级结构以α-螺旋为主。同源性分析显示兰州大尾羊MAPK13基因序列与已发布的绵羊MAPK13 mRNA序列（登录号：NM_001139455.1）相比，其第852位发生碱基转换（C↔A），导致编码蛋白第265位氨基酸发生碱基转换（S↔T），同时，第951位发生碱基转换（T↔G），但其所编码氨基酸不变。构建的基因进化树分析结果显示兰州大尾羊与牛亲缘关系最近。兰州大尾羊与其他物种MAPK13基因在结构上相似性较高，说明该基因具有高度的保守性，其序列包含的S_TKc结构域可将ATP的γ磷酰基转移到蛋白质丝氨酸/苏氨酸残基上，导致一系列肥胖相关基因的功能失调和表达变化，为进一步研究MAPK13基因与成脂分化过程的相关性提供了参考。

兰州大尾羊 MAPK13基因 cDNA 末端快速扩增 生物信息学

促分裂素原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinases，MAPK）链是真核生物信号传递网络中的重要途径之一［1］。MAPK通路主要包括ERK、p38MARK和JNK三条途径，主要作用于脂肪细胞组织中，其逐级磷酸化过程［2］涉及成脂分化的调控，与胰岛素抵抗、脂肪细胞分化密切相关［3］。p38 delta MAPK也称为MAPK13，是脂肪细胞分化的主要候选基因。兰州大尾羊（Lanzhou fat-tailed sheep）是清朝同治年间（1 862-1 875年）由陕西大荔一带引进的同羊与兰州当地蒙古羊杂交选育而成的地方绵羊品种，因其尾部脂肪过度沉积，导致尾大、脂肪充实而得名［4，5］。绵羊MAPK13基因克隆及其相关功能研究报道较少。1997年，Cohern等［6］用Ser/Thr磷酸酶处理使MAPKK失活，提出了存在MAPKK激酶的假说。Emanuelli［7］研究证实，胰岛素抵抗，二型糖尿病和肥胖均与MAPK有关。2005年，Bost等［8］研究发现，ERK小鼠脂肪细胞含量少于野生型小鼠，与对照组相比，高脂饲料喂养的ERK小鼠有较高的餐后代谢率，不易患胰岛素抵抗和肥胖。2009年，赵芳等［3］研究表明，ERK1/2，JNK和p38MAPK三条MAPK信号通路通过独立作用及复杂的协调作用，参与调控脂肪细胞分化过程的各个环节，其调节作用具有多样性。2013年，吕雯［9］脂肪细胞等研究表明，ERK和p38MAPKK两种MAPK信号通路对脂分化的调节在不同的试验模型中表现为正调控和负调控两种不同形式；而另一成员JNK能使胰岛素受体底物1的丝氨酸发生磷酸化，进而干扰胰岛素信号，从而抑制骨髓间充质干细胞（BMSCs）的成脂分化，即对脂肪细胞分化发挥负调控作用。关于MAPK通路对脂肪细胞分化发挥正调控作用，Haridas Nidhina［10］研究表明，香草精通过激活ERK通路，上调了前体脂肪细胞中PPARg的表达，增加了细胞葡萄糖的摄取量，促进了成脂分化。关于MAPK通路对脂肪细胞分化发挥负调控作用，Chuang［11］研究表明，ERF信号通路可以诱导白细胞介素表达，使其下游PPARg被磷酸化，导致PPARg下游生脂相关的靶基因表达水平降低，从而抑制了脂肪细胞分化。此外，Bordicchia等［12-15］的研究，也表明MAPK基因与脂肪代谢关系密切。基因调控是细胞分化的核心问题。目前，虽然有关MAPK13基因的研究在报道中较多，但兰州大尾羊是具有耐粗饲、抗病能力强、饲料利用率高、适应性强、肉质鲜美等优良地方绵羊品种，其尾部脂肪细胞分化与其它绵羊差异显著。迄今为止，MAPK13等脂肪细胞分化基因克隆及表达的相关报道较少［16］。脂肪细胞分化过程与脂肪细胞特异性功能基因的表达调控密切相关，涉及多种脂肪特异性转录因子的激活。本研究以兰州大尾羊为研究对象，应用RT-PCR技术获得cDNA，利用RACE法对MAPK13基因进行克隆和序列分析，为进一步研究MAPK13基因对兰州大尾羊尾部脂肪细胞分化的影响提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物 2012年3月于永登明鑫良种肉羊繁育场选购6月龄兰州大尾羊（羯羊），颈静脉放血后，快速切取尾部脂肪组织，切成小块，用锡箔纸包裹后液氮速冻，-80℃保存备用。兰州大尾羊脂尾肥大，方圆平展，自然下垂飞节上下，尾有中沟将尾部分为左右对称两瓣，尾尖外翻，并紧贴中沟，尾面着生被毛，内面光滑无毛，呈淡红色。由于该品种濒临灭绝，纯种存栏不足百只，利用正常繁育羊只开展研究工作受到了限制，因而屠宰了1只羯羊进行了研究。该羊尾脂重1.71 kg，占体重的3%，具有理想羊只的特征。以下实验于西北民族大学实验中心进行。

1.1.2 主要试剂 RNAiso Plus（TaKaRa）、SMART-erTMRACE cDNA Amplification Kit（Clontech）、DH5α感受态细胞（TaKaRa）、普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、pGM-T克隆试剂盒、质粒小提试剂盒、X-gal、IPTG、DNA Marker，6×loading buffer、胰蛋白胨、酵母提取物、琼脂粉、氯仿、异丙醇、0.1%DEPC、75%乙醇、RNase-free水、5×TBE 缓冲液、琼脂糖、氯化钠等均购自天根生物公司。

1.2 方法

1.2.1 脂肪组织总RNA的提取 通过TRIzol法提取总 RNA。

1.2.2 引物设计与合成 根据绵羊MAPK13mRNA序列（登录号：NM_001139455.1），按照SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit要求［17］，利用Primer 5.0软件设计引物，由上海生工合成。公司测序。

1.2.5 数据分析 利用DNASTAR软件对已获得的MAPK13序列片段进行拼接，对拼接的cDNA序列进行分析并推导其氨基酸序列；利用ProtParam（http：//us.expasy.org/tools/protparam.htmL）分析氨基酸序列的理化性［18］；利用IBCP（http：//npsa-pbil. ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html）预测蛋白质的二级结构［19］；利用PHYRE2（http：// www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index）预测蛋白质的三级结构［20］；利用 TMHMM（http：// genome.cbs.dtu.dk/services /TMHMM/）分析蛋白质的跨膜结构［21］；利用Protscale（http：//web.expasy. org/protscale/）分析蛋白质亲疏水性；利用NetPhos（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）分析蛋白质磷酸化位点；利用NetNGlyc（http：//www.cbs.dtu. dk/services/NetNGlyc/）分析蛋白质糖基化位点；利用 TargetP（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）分析蛋白潜在信号肽；利用SignalP4.0（http：//www. cbs.dtu.dk/services/SignalP/）分析蛋白分泌途径；利用 PSORT II Prediction（http：//psort.hgc.jp/form.html）预测蛋白质的亚细胞定位；利用 Smart（http：//smart. embl-heidelberg.de/）分析预测氨基酸序列的保守结构域；利用Blast和DNAman软件分析其同源性及构建系统发育树［22］。

1.2.3 cDNA第一链合成 cDNA 第一条链的合成根据SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit说明书进行操作。

1.2.4 RACE反应及产物回收 根据SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit中 3'-Full RACE Core Set 和 5'-Full RACE Core Set 2 5'-full race试剂盒进行兰州大尾羊MAPK13的 3'端与 5'端序列的扩增，具体操作步骤参考产品说明书，用CDS区引物CDS1和 CDS2按常规方法进行 RT-PCR 扩增。反应结束后各取 3'-RACE PCR 产物、5'-RACE PCR 产物和CDS区PCR 产物5.0 μL，用 12 g/L琼脂糖凝胶电泳。目标3'-RACE cDNA、5'-RACE cDNA和CDS区PCR产物经DNA凝胶回收试剂盒进行回收和纯化，连接至pDM19-T载体，提取质粒并送上海生工生物工程

2 结果

2.1 兰州大尾羊MAPK13基因cDNA末端快速扩增（RACE）

根据SMARTerTMRACE cDNA扩增试剂盒中5'-full race试剂盒和3'-full race试剂盒说明书进行的操作步骤。NGSP1扩增得到90 bp 5'-RACE cDNA，NGSP2扩增得到741 bp 3'-RACE cDNA；CDS区引物CDS1和CDS2扩增获得1 102 bp中间片段（图1）。

2.2 兰州大尾羊MAPK13基因cDNA 序列分析

将中间片段、5'-RACE 和 3'-RACE序列测序拼接后获得兰州大尾羊MAPK13基因1 397 bp的全长cDNA序列。MAPK13基因核苷酸序列及其编码蛋白的氨基酸序列如图2所示，兰州大尾羊MAPK13基因的开放阅读框为1 101 bp，起始密码子为ATG位于58 nt，终止密码子为TAG位于1 158 nt，编码367个氨基酸。编码区两侧翼分别具有5'-UTR 57 bp（1-57 nt）和3'-UTR 214 bp（1 158-1 397 nt）。其中C+G%=57.55%，分子量42.29 kD。

2.3 兰州大尾羊MAPK13蛋白质结构分析

2.3.1 基因蛋白理化性质分析 DNAstar软件分析表明，兰州大尾羊MAPK13基因cDNA编码蛋白质367个氨基酸残基中，有52个碱性氨基酸（K，R），占氨基酸总数的14.2%；47个酸性氨基酸（D，E），占氨基酸总数的12.8%；124个疏水氨基酸（A，I，F，W，V），占氨基酸总数的33.8%；87个极性氨基酸（N，C，Q，S，T，Y），占氨基酸总数的23.7%。

2.3.2 基因蛋白二级结构与三级结构预测 ProtParam程序分析表明兰州大尾羊MAPK13蛋白的的分子量为分子量42.29 kD，理论等电点为8.82。兰州大尾羊MAPK13蛋白中，α-螺旋（Alpha helix）占41.26%；随机卷曲（Random coil）占39.89%；延伸链（Extended strand）占18.85%（图2）。通过PHYRE2预测其三级结构（图3）。

2.3.3 MAPK13蛋白的保守结构域 根据 Smart软件推测，MAPK13蛋白质其第306-319个氨基酸残疾有一段LCR序列（表2，图4）。

2.3.4 蛋白基因跨膜结构与亲疏水性分析 TMHMM分析也表明兰州大尾羊MAPK13蛋白无跨膜螺旋，为非跨膜蛋白。利用ExPASy的Protscale分析蛋白疏水性（图5）发现，该基因编码蛋白疏水性最大值为2.078，最小值为-3.044。该氨基酸序列内绝大多数为疏水性残基，表明绵羊MAPK13基因编码蛋白为不溶性蛋白。

2.3.5 亚细胞定位 根据TargetP 和SignalP 软件预测，推测该蛋白无信号肽，不是分泌蛋白，大部分在游离核糖体上合成（表3）。将MAPK13蛋白序列输入 PSORT II Prediction，可以基本确认该基因蛋白不属于分泌蛋白，主要在细胞质（45%）和过氧化物酶体（36.5%）中发挥生物学作用，少量作用于溶酶体（10%）和线粒体基质（10%）（表4）。

2.3.6 蛋白基因磷酸化与糖基化位点分析 根据NetPhos 2.0 Server软件分析，结果（图6）表明MAPK13蛋白含有12个丝氨酸Ser，3个苏氨酸Thr，4个酪氨酸Tyr可以成为蛋白质激酶磷酸化的位点。根据NetNGlyc 1.0 Server软件分析，结果表明其含有3个糖基化位点：N15、N201、N347。

2.4 兰州大尾羊MAPK13基因及其编码蛋白与其他动物同源性比较

用Blast进行核苷酸同源性在线分析，结果表明兰州大尾羊MAPK13基因核苷酸序列与牛、人、海象、犬、猴、虎鲸、海豚和鼠核苷酸序列间的同源性分别为97%、92%、91%、91%、91%、90%、90%和88%，说明兰州大尾羊与绵羊和牛的亲缘关系较近，与鼠类亲缘关系最远。用DNAman软件进行氨基酸同源性分析，结果（图7）表明，兰州大尾羊MAPK13氨基酸序列与牛、猴、犬、海象、海豚、虎鲸、鼠和人核苷酸序列间的同源性分别为99.2%、87.8%、94.8%、93.7%、91.8%、92.1%、92.1%和81.1%，其中与牛同源性较高，与鼠和人类同源性较差。系统发育树（图7）也表明，兰州大尾羊与牛的进化水平更为接近，与人类较远。兰州大尾羊MAPK13基因序列与已发布的绵羊MAPK13mRNA序列（登录号：NM_001139455.1）相比第852位发生碱基转换（C←→A），导致编码蛋白第265位氨基酸发生碱基转换（S←→T），同时，第951位发生碱基转换（T←→G），但其所编码氨基酸不变（图8）。

3 讨论

本研究通过RT-PCR和RACE技术首次克隆了兰州大尾羊MAPK13基因cDNA 全长序列1 397 bp，其CDS区片段长1 102 bp，编码367个氨基酸。兰州大尾羊MAPK13基因核苷酸序列与牛、人、海象、犬、猴、虎鲸、海豚和鼠核苷酸序列间的同源性分别为97%、92%、91%、91%、91%、90%、90%和88%。兰州大尾羊MAPK13基因序列与已发布的绵羊MAPK13mRNA序列（登录号：NM_001139455.1）相比，其第852位发生碱基转换（C←→A），导致编码蛋白第265位氨基酸发生碱基转换（S←→T），同时，第951位发生碱基转换（T←→G），但其所编码氨基酸不变。系统发育树符合进化规律。由此可见，兰州大尾羊与各物种MAPK13基因序列间具有高度的保守性，从而预测生物体内由MAPK13基因所指导的生物学功能非常稳定。

预测MAPK13分子量为42.49 kD，为非跨膜的疏水性蛋白，无信号肽，不属于分泌蛋白。亚细胞定位主要在细胞质（45%）和过氧化物酶体（36.5%）中发挥生物学作用，少量作用于溶酶体（10%）和线粒体基质（10%）。综上推测MAPK13蛋白大部分在游离核糖体上合成，其功能与过氧化物酶体有关。该预测结果符合其促分裂素原活化蛋白激酶的身份。

MAP级联反应主要通过丝/苏/酪氨酸的磷酸化作用推进。S_TKc结构域由十几个保守半胱氨酸残基组成，具有丝/苏氨酸激酶催化功能，经上游MAPK激酶MKK3和MKK6激活，可将ATP的γ磷酰基转移到蛋白质丝/苏氨酸残基上，是细胞外信号反应的重要介质［24］。其催化核心的N端存在一个LLLL富集区，这个区域可能与ATP的结合有关。TyrKc酪氨酸激酶结构域与S_TKc功能基本相同，包含活性位点、ATP结合位点和底物结合位点，可催化ATP的γ磷酸基团转移到专一性底物如蛋白丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基的羟基基团［24］。MAPK级联放大过程中存在一个Ras-Raf-MAPKKMAPK信号转导通路，该通路则需要RasGap结构域的参与，Ras在PTKs介导的信号通路中也是一种关键组分。Ras蛋白是ras基因表达产物，具有GTPase活性，分布于质膜胞质一侧，结合GTP时为活化状态，而结合GDP时为失活态，所以Ras蛋白也是GTPase开关蛋白［25］。Yamakawa［26］通过对逆转录病毒法处理的小鼠B细胞进行筛选，发现RasGAP结合蛋白Dok-1作为一个酪氨酸磷酸化激活分子作用于其途径的下游，但其本身并没有被磷酸化，从而证明Dok-1是连接激活素受体与Smad蛋白的重要分子。Smads家族蛋白可以将TGF-β信号从细胞表面受体传导至细胞核，因此，RasGAP结构域间接地激活或抑制了靶基因的转录［27］。预测MAPK13氨基酸序列有19个可以成为蛋白质激酶磷酸化的位点，某些位点被磷酸化后，可导致一系列肥胖相关基因的功能失调和表达变化，如胰岛素增敏激素，脂联素（adiponectin）的表达减少［28，29］，从而推测其磷酸化反应过程可能与脂肪代谢相关联。保守结构域预测结果分析表明，兰州大尾羊MAPK13蛋白序列中含有3个磷酸化功能结构域：S_TKc丝/苏氨酸激酶结构域、TyrKc酪氨酸激酶结构域和Rio丝氨酸激酶结构域，1个RasGAP信号传导结构域，1个CPSase_sm谷氨酰胺氨基转移酶结构域，1个IENR1核酸内切酶结构域，1个MgtE_N Mg2+转运结构域。说明MAPK13基因可能通过磷酸化调控兰州大尾羊脂肪代谢和局部沉积，是研究兰州大尾羊尾部脂肪细胞分化的重要候选基因。

4 结论

应用RACE技术首次克隆了兰州大尾羊MAPK13基因1 397 bp全长cDNA序列（登录号：KF770837），并对其核苷酸与编码氨基酸序列特性进行了研究，为进一步研究绵羊MAPK13基因功能提供参考。

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（责任编辑 李楠）

Cloning and Bioinformatics Analysis of MAPK13 Gene in Lanzhou Fat-tailed Sheep

Jin Fangyuan1Xu Hongwei2Da Xiaoqiang1Zang Rongxin1Bai Jialin1Gao Xin2Cai Yong2Feng Yulan1Yang Jutian2
（1. College of Life Science and Engineering，Northwest University for Nationalities，Lanzhou 730030；2. Science Experimental Center，Northwest University for Nationalities，Lanzhou 730030）

The objective of this study is to reveal the biological function of mitogen-activated protein kinases（MAPK）gene in sheep and provide theoretical data for application by cloning MAPK and analyzing its sequence as well as genetic features. The specific primers on the CDS template of MAPK13 gene were designed and then the MAPK13 gene sequence of Lanzhou fat-tail sheep was cloned using RACE and RTPCR technology. After that, its genetic characteristics were analyzed by bioinformatics methods. The 1 397 bp full-length cDNA of MAPK13 of Lanzhou fat-tailed sheep was obtained, in which the length of CDS is 1 102 bp. It encodes 367 amino acids in total. It was predicted that the molecular weight of MAPK13 protein of Lanzhou fat-tail sheep is 42.29 kD and its theoretical isoelectric point is 8.82. It is a non-transmembrane hydrophobin with no signal peptide, which locates mostly in cytoplasm by the result of subcellular level prediction and does not belong to the secretory protein. Its amino acid sequence contains 19 phosphorylation sites, 3 glycosylation sites, 3 phosphorylation domains, 4 other domains and 1 LCR domain. Also, its secondary structure is mainly randomly curly. Nucleotide sequence analysis revealed that the gene nucleotidesequence of Lanzhou fat-tail sheep has some different from the known sheep MAPK13 mRNA（Genbank No.：NM_001139455.1）. Base transition occur in the 852th site is（C vs. A）, respectively, the corresponding amino acids in the 265th is（S vs. T）. Base transition occur in the 951th site is（T vs. G）, but the corresponding amino acids do not change.The phylogenetic tree indicates that Lanzhou fat-tail sheep is close to bos. The fact that the structure of MAPK13 of Lanzhou fat-tail sheep highly similar with other species indicates that the gene is highly conservative. The S_TKc domain in the sequence can transfer the gamma phosphoryl of ATP to the serine / threonine residues of protein, leading to function imbalance and expression change in a series of obesity related gene.

Lanzhou fat-tailed sheep MAPK13 gene RACE Bioinformatics analysis

2014-01-23

国家自然科学基金项目（31160440，31260533，31360529）,甘肃省科技支撑计划项目（1011NKCA051）,兰州市科技计划项目（2011-1-113），西北民族大学研究生科研创新项目（ycx13175）

金方园，E-mail：373995197@qq.com

杨具田，教授，硕士生导师，E-mail：jutianyang988@163.com；臧荣鑫，教授，硕士生导师，E-mail：rongxinzang2000@163.com