牦牛PAFR基因生物信息学分析及其在妊娠前后子宫中的表达

魏博 潘阳阳 禹尧 田枫 余四九

（甘肃农业大学动物医学院，兰州 730070）

牦牛PAFR基因生物信息学分析及其在妊娠前后子宫中的表达

魏博 潘阳阳 禹尧 田枫 余四九

（甘肃农业大学动物医学院，兰州 730070）

以牦牛血小板活化因子受体（Platelet-activating factor receptor，PAFR）基因为研究对象，采取西宁家养牦牛子宫为材料，采用RT-PCR技术克隆牦牛PAFR基因，对其进行生物信息学分析，并采用QRT-PCR方法定量检测PAFR在牦牛子宫不同时期的表达。结果表明，牦牛PAFR基因编码区长1 029 bp，编码342个氨基酸；氨基酸序列与黄牛同源性最高为99.7%，与非洲爪蟾蜍同源性最低为59.1%，表明PAFR氨基酸在进化过程中具有保守性；其编码蛋白的氨基酸序列有5个跨膜区域，推测其可能为跨膜蛋白；具有亲水性；未发现信号肽片段；含有G蛋白偶联受体家族结构域；QRT-PCR检测PAFR在牦牛子宫中表达，妊娠期最高，卵泡期最低，黄体期居中，揭示其与胚胎附植，妊娠维持有关。

牦牛 PAFR 基因克隆 生物信息学分析 基因表达

牦牛是中国仅次于黄牛和水牛的主要牛种之一，也是牛属动物中能适应高寒气候而延续至今的珍稀畜种资源。其主要分布在我国青藏高原和甘肃等地。由于其繁殖能力不强，所以利用日趋完善的人工受精及胚胎移植等技术对牦牛进行珍惜物种资源保护，提高其繁育生产能力必将成为未来发展趋向。

血小板活化因子（Platelet-activating factor，PAF）是一种内源性磷脂递质，其化学名称为1-O-烷基-2-乙酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱。PAF是目前发现的作用最强的脂质递质，它广泛存在于各种组织［1］。PAF在生殖方面具有多种生物学活性，其在受精、附植和妊娠过程中扮演重要角色［2，3］。目前以PAF在子宫中的表达研究较多。1986年Yasuda 等［4］在小鼠子宫中发现PAF浓度变化，O'Neil等［5］也发现PAF与小鼠附植前胚胎发育关系密切。不久Angle等［6］证实了家兔子宫中PAF浓度变化与附植过程有关。而PAF的生物学活性是通过与其受体（Platelet-activating factor recepter，PAFR）结合从而表达的。PAFR是在［3H］-PAF和PAF受体拮抗剂——［3H］-WEB2086的配体结合试验中发现的［7，8］。1991年Honda等［9］建立了豚鼠肺PAFR的cDNA克隆，并成功进行了表达。后续研究中，在兔［10，11］、人［12］、牛［13］、犬［14］的子宫中也都检测到了PAFR的分布，但PAFR在牦牛子宫中还未被检测到。鉴于此，本研究对牦牛PAFR基因编码区序列进行克隆，对其编码蛋白序列进行生物信息学分析，并检测其在妊娠前后牦牛子宫中的含量。以期阐明牦牛PAFR基因分子的遗传特性，为进一步揭示PAF在牦牛生殖过程中发挥的作用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 组织 青海省西宁市定点屠宰场。分别取卵泡期、黄体期、妊娠期雌性牦牛子宫组织样，用锡纸包裹后放入标记好的布袋中，立即投入液氮中带回，-80℃保存备用。

1.1.2 主要仪器和试剂 罗氏 LightCycler 480定量PCR仪，Bio-Rad常规PCR仪；引物由上海华大基因合成；柱式动物组织RNA抽提纯化试剂盒，Taq PCR Master Mix购自生工生物公司，PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser，pMDR18-T vector购自 TaKaRa公 司，Gel Extraction Kit（100）D2500-01购自OMEGA公司，TransStartTMTop Green qPCR SuperMix购自TransGen Biotech公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 从GenBank 数据库中检索黄牛的PAFR基因（XM_005203162.1）的cDNA序列和β-actin基因（XM_004970638.1），用Primer Premier 5设计4对引物（表1）。其中引物1、2为用于RT-PCR的PAFR引物；引物3为用于QPCR的PAFR引物。β-actin引物作为内参检测引物。

1.2.2 总RNA的提取及反转录 用生工生物工程柱式动物组织RNA抽提纯化试剂盒提取总不同时期牦牛子宫RNA，具体步骤参照说明书。用 PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa）对总RNA 进行反转录，合成牦牛子宫的cNDA。具体操作步骤参照说明书。采用β-actin为内参基因，β-actin引物引自Ann-Sofi Bergqvist，PCR扩增后，1.5%琼脂糖凝胶电泳和紫外线分光光度计检测cDNA的质量，-20℃保存。

1.2.3 牦牛PAFR基因的扩增与克隆 引物1、引物2及β-actin引物的扩增体系及反应条件相同。反应体系：上下游引物各0.5 μL（10 pmol/L），模板1 μL，Taq PCR Master Mix（生工生物公司）10 μL，无菌去离子水8 μL。反应条件：94℃预变性4 min；94℃变性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸40 s，34个循环；72℃延伸10 min。扩增产物的大小及质量用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。将目的条带用Gel Extraction Kit（100）D2500-01（OMEGA公司）回收纯化，将纯化好的cDNA与pMDR18-T vector连接，并转化到JM109感受态细胞中，将菌液送华大基因测序。

1.2.4 牦牛PAFR基因的生物信息学分析 用MEGA5软件对克隆测序得到的目的基因进行拼接编辑，及基因编码氨基酸序列的推导；用ORF Finder软件（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi）进行开放阅读框分析；用在线软件ProtParam（http：//web. expasy.org/protparam/）分析牦牛PAFR基因编码蛋白理化性质；用ProtScale（http：//web.expasy.org/prots cale/）软件分析其疏水性质。

利用NCBI的BLAST在线软件进行对比分析，再用DNAMAN软件进行同源性分析；使用MEGA 5.1 软件构建PAFR基因的系统发生树。用于同源性及系统进化分析的其他物种的PAFR基因序列从GenBank中下载，各物种PAFR基因序列登录号，见表2。

用在线软件SignalP4.1（http：//www.cbs.dtu.dk/ services/SignalP-4.1/）分析预测蛋白质的信号肽位点；用在线软件TMHMM Server V 2.0（http：//www. cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）对预测蛋白进行跨膜区分析。

使用软件Interpro（http：//www.ebi.ac.uk/interp ro/）预测蛋白所包含的结构域；用在线软件SOPMA（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page= /NPSA/npsa_sopma.html）预测蛋白质的二级结构；用在线软件SWISS-MODEL（http：//swissmodel.expas y.org/）对牦牛PAFR蛋白进行三级结构预测。

1.2.5 妊娠前后牦牛子宫中PAFR基因的检测 牦牛子宫按照卵泡期、黄体期、妊娠期分为3组，每组3个复孔，分别为待测孔、内参对照孔和空白对照孔，每组3个重复。将各组样品cDNA浓度均调至160 ng/μL。反应体系（20 μL）体系：2× TransStart Top Green qPCR SuperMix 10 μL，上下游引物各 0.5 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 8 μL。扩增程序：95℃ 5 min；95℃ 10 s，57℃ 15 s，72℃ 15 s，45个循环；95℃ 5 s，65℃ 1 min；40℃ 30 s。试验数据用SPSS 19.0软件进行分析。

2 结果

2.1 牦牛PAFR基因的扩增与克隆

反转录获得的cDNA经PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测后，结果如图1所示。扩增产物大小与引物预期产物大小一致。用MEGA软件进行拼接编辑后，利用NCBI的BLAST软件在线比对分析确定，PAFR与其引物设计参考序列一致性为99%，因此可以判定引物1、2经拼接编辑得出序列为牦牛PAFR基因。并已将其提交保存到GenBank中，收录号为KF771404。

2.2 牦牛PAFR基因的生物信息学分析

2.2.1 牦牛PAFR基因编码蛋白的理化性质 测序结果经MEGA5软件拼接后，获得的PAFR基因序列用在线软件ORF Finder，检测到一条长1 029 bp的开放阅读框，推测可编码342个氨基酸。使用在线软件ProtParam 预测牦牛PAFR基因编码蛋白的理化性质发现，该蛋白分子量为39.637 kD，理论等电点为9.16。含有20种氨基酸，其中含量最高的是Leu（12.0%），含量最低的为Met（1.8%）、Trp（1.8%）。含有带负电氨基酸（Asp + Glu）21个，带正电氨基酸（Arg+ Lys）33个。利用在线软件ProtScale分析牦牛PAFR基因氨基酸序列的亲疏水性结果（图2）表明，PAFR 氨基酸序列第199、200位Leu、Phe预测的分值最高为3.667，其疏水性最强；第160位Lys分值最低为-2.833，其亲水性最强。牦牛PAFR基因编码的整个氨基酸序列中亲水性氨基酸多于疏水性氨基酸，因此整体表现为亲水性。

2.2.2 牦牛PAFR基因编码蛋白的系统发育分析 利用DNAMAN软件对牦牛PAFR基因的核苷酸序列与牛、人、藏羚羊、野猪、犬、虎鲸、非洲爪蟾蜍、大鼠、小鼠等物种进行同源性对比，结果见表2。分析发现牦牛PAFR氨基酸序列与其它物种的相应序列有较高的同源性，其中与黄牛的同源性最高为99.7%；其次是藏羚羊和绵羊，同源性为96.8%；与非洲爪蟾蜍的同源性最低，为59.1%。根据与其他物种的同源性对比结果，使用MEGA 5.1软件中的最大可能性法（Maximum Likelihood methods）绘制出PAFR基因的系统进化树，如图3。

2.2.3 牦牛PAFR基因编码蛋白信号肽、跨膜区及结构域分析 利用SignalP软件对牦牛PAFR进行信号肽预测，结果显示序列中无信号肽，如图4。

利用TMHMM软件对牦牛PAFR进行跨膜区分析，结果显示PAFR有5个跨膜区，有139个氨基酸残基在细胞外，如图5，推测PAFR可能是跨膜蛋白。

利用Interpro软件预测牦牛PAFR蛋白结构域，结果如图6所示，该序列在第32-293位氨基酸之间有G蛋白偶联受体（GPCR）家族蛋白功能结构域，同时在2-20、39-55、73-89、109-134、149-171、171-188、211-232、247-261、268-280、294-316及317-341位氨基酸之间有血小板活化因子受体（PAFR）家族蛋白功能结构域。

2.2.4 牦牛PAFR基因编码蛋白二级结构、三级结构预测 使用SOPMA 软件预测牦牛PAFR蛋白的二级结构，结果（图7）表明，该蛋白α-螺旋区为130个氨基酸，占38.01%；延伸链为85个氨基酸，占24.85%；β-转角为5 个氨基酸，占1.46%；无规卷曲为122个氨基酸，占35.67%。

利用Swiss Model 数据库预测该蛋白的三维结构，提交序列至Swiss Model服务器进行自动建模，得到其三维结构。如图8所示，PAFR蛋白为一种结构较松散的球状蛋白。

2.3 PAFR在妊娠前后牦牛子宫中的表达

由相对定量的结果可知，PAFR基因在妊娠期子宫中的表达量最高，以妊娠期牦牛子宫△Ct平均值为基准，其余两时期的△Ct平均值分别与妊娠期△Ct平均值作差，即得到△△Ct，其他两时期PAFR基因的表达量相对于妊娠期PAFR基因的表达量即为2-△△Ct。从表3、图9可以看出，牦牛PAFR基因在妊娠期的表达量，约是在黄体期表达量的1.6倍，是卵泡期表达量的2.8倍。

3 讨论

血小板活化因子（PAF）能够广泛参与排卵、附植、胚胎发育及妊娠等生殖生理活动［15］，因其生物学活性是通过与其受体（PAFR）特异性结合从而表达，因此PAFR基因近年来备受关注。本试验克隆了牦牛PAFR基因，然后对该基因进行了生物信息学分析，并对其在妊娠前后牦牛子宫中的表达量进行了检测。结果表明，PAFR基因含有一个1 029 bp的开放阅读框，编码342个氨基酸。其编码氨基酸序列经推测有5个跨膜区，说明牦牛PAFR蛋白为跨膜蛋白，结构域预测发现牦牛PAFR蛋白含有G蛋白偶联受体家族结构域，说明其属于G蛋白偶联受体家族，这与Honda等［9］的结论相符。自1991年Richard等［16］克隆出人PAFR基因，已有10余种物种PAFR基因被克隆出来，本试验通过对不同物种PAFR氨基酸序列对比分析，发现牦牛PAFR氨基酸序列与黄牛PAFR氨基酸同源性最高为99.7%，与其它物种也有较高的同源性，表明PAFR氨基酸在进化过程中具有保守性。

O’Neill等［17］认为附植前胚胎产生的PAF介导妊娠母体对胚胎的识别，引起母体对妊娠的最初反应，以及胚胎附植时母胎界面伴随的炎症可能也和PAF 密切相关。本试验采用QRT-PCR的方法相对定量检测出PAFR在妊娠前后牦牛子宫中的表达量，结果显示妊娠后子宫内的PAFR表达量明显高于妊娠前各时期。揭示PAFR在牦牛妊娠过程中扮演重要作用，这与O’Neill［5］、Angle等［6］在鼠和家兔子宫中的发现一致，进一步验证了PAF对胚胎附植，维持妊娠起到了重要作用。本试验首次在牦牛子宫中克隆出PAFR，并全面地对PAFR进行了生物信息学分析，为以后深入研究PAF及PAFR提供了可靠依据。

4 结论

牦牛PAFR基因，其开放阅读框全长1 029 bp，编码342个氨基酸；与黄牛相比氨基酸同源性最高为99.7%，较保守；该蛋白为跨膜蛋白，有亲水性，具有G蛋白偶联受体家族结构域；在牦牛子宫中PAFR表达，妊娠期高于妊娠前，说明其与胚胎附植，维持妊娠有关。

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（责任编辑 李楠）

Cloning and Sequence Analysis of Yak PAFR Gene and Expression in Uterus Before and After Pregnancy

Wei Bo Pan Yangyang Yu Yao Tian Feng Yu Sijiu
（College of Veterinary Medicine，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070）

Platelet-activating factor receptor（PAFR）gene were cloned from uterus of domestic yak by reverse transcription polymerase chain reaction（RT-PCR）. The results shows that domestic yak PAFR gene was 1 029 bp in length, encoded predicted mature protein of 342 amino acids, which encoded a hydrophilic protein. Compared with the reference sequence of PCR primer designing homology of the domestic yak PAFR coding sequence was 99.7% at the amino acid level, and also showed high homology of with other species. The PAFR has 5 transmembrane domains, features G protein-coupled receptor domains, no signal peptide. The result of the quantitative Real-time Polymerase chain reaction（QRT-PCR）shows that PAFR was highest expression in gestation and lowest in follicular phase in uterus of domestic yak. That suggested PAFR play an important role in implantation and gestation.

Yak PAFR Gene cloning Bioinformatic analysis Gene expression

2014-01-09

国家自然科学基金项目（32172616）

魏博，男，硕士研究生，研究方向：动物生殖生理；E-mail：jl_wb_cloud@163.com

余四九，男，教授，博士生导师，研究方向：动物生殖生理；E-mail：sjyu@163.com